梁藝璇，吳 潔

(中國藥科大學生命科學與技術學院酶工程實驗室，南京 210009)

中性粒細胞在捕獲和殺滅病原體過程中發(fā)揮重要作用，是人體免疫防御的第一道防線[1]?；罨闹行粤＜毎麜尫抛陨砭€粒體和核內染色質DNA到胞外，以DNA為骨架包裹各種顆粒蛋白酶形成纖維網(wǎng)狀結構，稱為中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)[2]。NETs的誘捕作用能使機體有效地防御病原體感染[3]。盡管NETs具有殺菌活性，然而越來越多的證據(jù)表明，過量的NETs具有促炎特性并導致宿主細胞損傷[4-6]。因此，NETs過量形成或清除受阻是許多疾病的潛在基礎，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎、糖尿病、血栓和肺損傷等[7-11]。

NETs只有在自身結構完整的情況下才能維持其抗原性[12]，因其主要結構成分是DNA，所以可通過破壞NETs的DNA骨架降解NETs[13]。人脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease I，DNase I)是一種酸性糖蛋白，具有核酸內切酶活性。在Ca2+和Mg2+等二價金屬離子存在的條件下，作用于單鏈或者雙鏈DNA的磷酸二酯鍵，通過水解生成單核苷酸或者5′端為磷酸基團，3′端為羥基的寡核苷酸[14]。DNase I不僅可以降解外源DNA，還在細胞凋亡、降解壞死細胞的染色質方面起到很大作用，并在小鼠乳腺癌、胰腺癌模型[15-17]、肺損傷[18]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[19]中被證實可發(fā)揮一定的功效。

為深入研究DNase I與NETs相關疾病的關系，本實驗成功構建了原核表達質粒pET32a-His-DNase I并轉化至E.coliRosetta(DE3)中，建立了純化His-DNase I的簡要工藝。

1 材 料

1.1 菌種、質粒及實驗動物

宿主菌為大腸埃希菌Rosetta(DE3)，克隆質粒pGEM-DNASEI購自北京義翹神州科技有限公司；表達質粒為pET-32a(+)，含氨芐青霉素(Amp)抗型基因，由華安生物技術有限公司提供。SPF級BALB/c雌性小鼠(4～6周齡)自揚州大學購買，合格證號:SCXK(蘇)2017-0007，動物實驗符合動物倫理委員會批準。

1.2 試 劑

NcoⅠ、XhoⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶(美國賽默飛世爾公司)；Ni Sepharose High performance(美國通用醫(yī)療公司)；質粒小量制備試劑盒(上海生物工程有限公司)；PCR產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠切膠回收試劑盒(北京天根生物科技有限公司)；引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；DNA Marker、蛋白預染Marker(北京全式金生物科技有限公司)；氨芐青霉素(上海源葉生物科技有限公司)；中性粒細胞提取試劑盒(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)；細胞爬片(上海晶安生物科技有限公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；佛波酯(PMA，美國Sigma-Aldrich公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；其他試劑均為國產分析純。

2 方 法

2.1 His-DNase I融合蛋白表達載體的構建

按照人DNase I的氨基酸序列，采用大腸埃希菌偏愛密碼子獲得人DNase I的DNA序列。利用引物設計軟件Oligo分別設計上游引物P1和下游引物P2，P1:5′-CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCATGCGTGGTAT GAAAC-3′,P2:5′-CCGCTCGAGTTATTTCAGCATAACTTCCACC-3′。

通過引物設計上游引物P1，即在該擴增的DNase I基因的5′端加入6個組氨酸(His)標簽，同時在連接處加入2個連續(xù)的絲氨酸作為柔性肽，引入酶切位點NcoⅠ，下游引物P2引入XhoⅠ酶切位點。采用PCR技術，獲得His-DNase I基因序列。

擴增條件為98 ℃預變性5 min；98 ℃變性1 min，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

分別用NcoⅠ、XhoⅠ將PCR產物與pET32a載體質粒雙酶切，純化后加T4 DNA連接酶4 ℃連接過夜，將酶連產物轉化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞。將重組菌的感受態(tài)細胞用無抗性的LB液體培養(yǎng)基重懸，于搖床37 ℃，50 r/min培養(yǎng)1小時后涂布在含氨芐抗性的固體平板中，倒置培養(yǎng)12 h，次日挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，保存菌種后抽提質粒，PCR方法驗證，質粒信息由南京金斯瑞生物科技有限公司測定。

2.2 融合蛋白的誘導表達及純化

將鑒定成功的重組菌接種于LB液體培養(yǎng)基5 mL中(含50 μg/mL的氨芐青霉素)，37 ℃過夜活化。次日轉接于LB液體培養(yǎng)基50 mL中培養(yǎng)，每1小時取樣測定A600，繪制生長曲線。

根據(jù)生長曲線，將重組菌培養(yǎng)3 h后，加入乳糖(終濃度5 mmol/L)后繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0，1，2，3，4，5,6 h取樣，離心收取菌體沉淀，進行12% SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白的位置及表達量。按每克濕菌體加入菌體裂解緩沖液20 mL的比例重懸菌體，充分混勻，超聲破碎后，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，分別收集上清液和沉淀，用12% SDS-PAGE蛋白電泳檢測分析，確定融合蛋白的表達形式。

按每克菌體沉淀濕重加入洗滌液Ⅰ(20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.0)20 mL的比例溶解包涵體，充分混勻后，12 000 r/min，4 ℃，離心20 min，棄上清液；沉淀再依次用洗滌液Ⅱ(以20 mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解的含2 mol/L的尿素溶液)、洗滌液Ⅲ(以20 mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解的含1% Triton X-100的溶液)、洗滌液Ⅰ、蒸餾水按同樣的方法洗滌，棄上清液，留沉淀，取部分沉淀用12% SDS-PAGE檢測。

洗滌后的包涵體沉淀，每克濕重加入含8 mol/L尿素的包涵體溶解液40 mL，4 ℃攪拌6 h以上，使沉淀變性溶解。12 000 r/min離心20 min，棄沉淀，收集上清液。

將溶解后的目的蛋白上清液用0.45 μm濾膜過濾，過濾后進行鎳離子親和柱純化，分別用30和300 mmol/L咪唑進行洗脫，收集各峰的洗脫液，12% SDS-PAGE分析目的蛋白的洗脫峰。收集的含高純度目的蛋白的上清液在不斷攪拌的情況下緩慢滴加到分別含6、4、3、2、1、0 mol/L尿素的復性緩沖液(5%甘油，1% L型精氨酸，2%甘氨酸，尿素，使用1×PBS溶解)中進行透析復性。

將復性蛋白溶液4 ℃，12 000 r/min離心20 min，棄沉淀，收集上清液。上清液用4 ℃預冷的蒸餾水透析，每隔4小時換一次液，4 ℃條件下透析24～48 h，用AgNO3溶液檢測透析液，直至無白色沉淀方可確定透析完畢。除鹽后的蛋白溶液凍干保存。

2.3 中性粒細胞提取

采用眼眶靜脈叢取血法于抗凝管中各采集新鮮小鼠外周血3 mL，上下顛倒以防凝血。將中性粒細胞分離液3 mL加至干凈的離心管，再加入80%濃度的細胞分離液1.5 mL，形成梯度界面。沿離心管壁緩慢地將等體積已加入紅細胞沉降液的抗凝血小心加至分離液的上層。室溫條件下，水平離心機離心，1 690 r/min離心30 min。離心后可見不同的分層，小心吸去離心后的上兩層(血漿層和單個核細胞層)，并將第3層(含中性粒細胞的混濁分離層與少量紅細胞層)轉移至另一干凈的離心管中。于新離心管中加入不含Ca2+、Mg2+的HBSS(D-Hank′s)液10 mL，上下顛倒數(shù)次，輕吹懸浮細胞。1 690 r/min離心5 min后棄上清液，在管底加入紅細胞裂解液3 mL裂解殘余的紅細胞，上下吹打混勻，裂解1 min,1 690 r/min離心10 min。直至裂解完全后，加入PBS及基礎培養(yǎng)基2 mL，重懸沉淀，1 690 r/min離心5 min洗滌。離心后用完全培養(yǎng)基重懸細胞，將提取后的中性粒細胞瑞氏染色，顯微鏡下觀察并計數(shù)不同視野中中性粒細胞，統(tǒng)計分析其純度。

2.4 佛波酯(PMA)誘導NETs形成

調整分離所得的外周血中性粒細胞濃度至每毫升1×106個細胞。將細胞重懸后轉至無菌全黑96孔酶標板，每孔200 μL。在 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5～1 h靜置處理細胞，空白組加DMSO 10 μL，各實驗組加PMA(終濃度80 μmol/L)10 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。

2.5 融合蛋白降解NETs活性

誘導NETs形成后，將DNase I溶液(終濃度為50，100，200 μg/mL)或NaCl溶液(DNase I的溶劑)加入到PMA刺激后的中性粒細胞孔中，DMSO對照組中加入同等體積的NaCl溶液，每個梯度重復3個復孔。加入SytoxGreen 0.2 μL，避光反應15 min 后，熒光酶標儀檢測熒光強度(RFU，Ex：485/20，Em:528/20)。根據(jù)熒光強度檢測融合蛋白對NETs的降解活性。

同時，提取的中性粒細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，細胞按每孔5×105個細胞接種至預先置入多聚賴氨酸處理的無菌玻璃片的24孔板。加入PMA誘導NETs形成，再加入終濃度為200 μg/mL的融合蛋白，輕微搖動混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。培養(yǎng)結束后取出細胞爬片，DAPI避光染色5 min，熒光顯微鏡觀察融合蛋白降解NETs情況。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計，采用單因素方差分析組間差異，P<0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 E.coli Rosetta(DE3)/pET32a-His-DNase I的構建

如圖1所示構建pET32a-His-DNase I質粒。提取pGEM:DNase I質粒后采用PCR方法獲得含有NcoⅠ及XhoⅠ雙酶切位點的His-DNase I基因，將其與pET-32a(+)用NcoⅠ及XhoⅠ雙酶切，如圖2。T4 DNA連接酶過夜連接兩片段后轉化至E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)中，挑選單克隆。將含有質粒的陽性克隆培養(yǎng)于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h，采用質粒提取試劑盒提取質粒，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外光下觀察電泳結果，與預計大小基本一致。將挑選的陽性克隆菌的質粒進行雙酶切，酶切片段與預計大小一致，如圖3。將挑選的陽性克隆進行測序驗證，經(jīng)比對后所有堿基均與設計的相一致，證實成功構建包含重組質粒pET32a-His-DNase I基因工程菌。

Figure 1 Schematic diagram of the plasmid pET32a-His-DNase I

Figure 2 0.8% Agarose electrophoresis analysis of the vector plasmid pGEM:DNase I (A),PCR products (B) and restriction enzyme digestion of plasmid pET-32a(+) (C)

Figure 3 0.8% Agarose electrophoresis analysis of plasmid pET32a-His-DNase I

3.2 His-DNase I融合蛋白的表達與純化

根據(jù)測定的A600，繪制工程菌的生長曲線(圖4)。乳糖誘導表達融合蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE分析，目的蛋白條帶在50 kD附近，且在誘導4 h時表達量最高，通過Bandscan軟件分析融合蛋白的表達量可達菌體總蛋白量的50%(圖5-A)。誘導表達后的菌體經(jīng)超聲破碎裂解后，分別取上清液和沉淀進行12% SDS-PAGE 分析。結果表明，重組蛋白His-DNase I絕大部分是以包涵體形式存在于沉淀中(圖5-B)。將超聲破碎后的菌體沉淀用8 mol/L尿素溶解，經(jīng)鎳柱親和色譜，對洗脫液進行分析，結果表明融合蛋白在咪唑濃度為300 mmol/L時被洗脫(圖5-C)。經(jīng)復性后，該蛋白于50 kD處有明顯條帶(圖5-D)。

Figure 4 Growth curve of E. coli Rosetta(DE3)/pET32a-His-DNase I

Figure 5 12% SDS-PAGE analysis of the fusion protein His-DNase I

3.3 His-DNase I融合蛋白降解NETs活性

NETs形成過程中，會釋放出大量胞內染色質，因此可以通過DNA熒光強度來檢測NETs水平。

提取小鼠外周血中性粒細胞，分析其純度為90%，經(jīng)PMA刺激形成NETs。如圖6所示，中性粒細胞在PMA刺激后產生的游離DNA水平顯著高于溶劑DMSO組，加入不同濃度梯度的His-DNase I，DNA熒光強度降低，說明PMA有效誘導中性粒細胞體外形成NETs，His-DNase I能以濃度依賴性的方式降解NETs的DNA骨架。

提取的中性粒細胞接種于24孔板制備細胞爬片。加入PMA誘導NETs形成，再加入His-DNase I融合蛋白，DAPI染色后熒光顯微鏡觀察，可以明顯看到經(jīng)PMA刺激形成的NETs網(wǎng)狀結構能夠有效地被His-DNase I降解(圖7)。

Figure 6 Degradation activity of His-DNase I on neutrophil extracellular traps (NETs) in vitro detected by SytoxGreen

Figure 7 Degradation activity of His-DNase I on NETs in vitro detected with fluorescence microscopy

4 討 論

NETs相關自身免疫性疾病的病理研究表明，在炎性反應期內，體液中NETs水平升高[20]。DNA是NETs的主要結構成分，且NETs中的DNA能以游離狀態(tài)存在于人體外周血中，表現(xiàn)形式為cf-DNA/NETs (neutrophil-derived circulating free DNA)。在各種炎性病理學中觀察到NETs與血漿和血清等體液中cf-DNA水平具有相關性[21-23]。因此，cf-DNA可用作NETs的替代標記物，而DNA水平的測定可有助于監(jiān)測疾病活動和評估治療策略的有效性。Margraf等[24]建立了血漿cf-DNA/NETs快速定量的檢測方法(Quant-iT PicoGreen dsDNA assay)，能夠特異性地檢測血漿中來自中性粒細胞的cf-DNA/NETs。Cf-DNA能通過多種機制介導炎癥反應[25]，但可被DNase降解[22]。鑒于NETs在多種免疫疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，DNase I作為NETs的負性調節(jié)因子，為研究自身免疫性疾病的病理生理機制、預防或延緩炎性期組織病理性損傷提供了新思路。

由于天然提取法原料來源的限制以及產品品質的批間差異較大，因此利用工程菌或工程動植物細胞高效表達hDNase I具有很大的優(yōu)勢。大腸埃希菌表達系統(tǒng)具有成本低、遺傳背景清楚、表達量高和表達產物分離純化相對簡單等優(yōu)點[26]。本實驗采用大腸埃希菌表達系統(tǒng)，通過分子生物學方法設計和構建含有DNase I基因的表達載體pET32a-His-DNase I，經(jīng)過乳糖誘導，融合蛋白以包涵體的形式表達，表達量較高。本次實驗通過添加組氨酸標簽進行蛋白的純化，充分利用了組氨酸標簽系統(tǒng)縮短蛋白分離純化時間、增強融合蛋白穩(wěn)定性的優(yōu)勢，經(jīng)鎳柱親和色譜純化后，融合蛋白的純度也較高。

生理性的DNase I在降解壞死細胞的染色質方面起到關鍵作用[27]。高濃度DNase I(5 mg/mL)可以完全降解NETs，但這個濃度遠遠高于生理性DNase I濃度(20 ng/mL)[28]。本研究通過分離小鼠外周血中性粒細胞在體外刺激形成NETs，加入DNase I后檢測游離DNA水平的方法判斷其活性。結果表明，融合蛋白DNase I在高于20 μg/mL濃度時能顯著地在體外降解NETs的DNA骨架，表現(xiàn)出較高的酶活性?？梢娫谏憝h(huán)境下DNase I活性不足時通過補充外源性的DNase I具有一定可行性。但由于大腸埃希菌表達的蛋白是未糖基化的，雖然具有降解活性，但是未明確糖基化及活性之間的關系。此外，有研究表明目的蛋白添加組氨酸標簽可能會影響到其生物活性[29]，因此后續(xù)的研究將驗證此標簽對DNase I活性的影響。

本研究為進一步探究DNase I用于NETs相關自身免疫疾病的研究奠定了基礎。