婁東曉，嚴(yán) 冬，郭 敏，王 慶，蔣翠花，殷志琦

(1中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥制劑系&天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；2江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京 210028；3昆明生達(dá)制藥有限公司，昆明 650033)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，發(fā)熱是由于外生致熱源通過刺激機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)生致熱源從而刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞將體溫調(diào)定點(diǎn)升高，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)熱增加、散熱減少引起的[1]。外生致熱源包括細(xì)菌、病毒、真菌、炎癥滲出物、抗原抗體復(fù)合物等，其多為大分子物質(zhì)不能透過血-腦脊液屏障，作用于內(nèi)生致熱源細(xì)胞釋放內(nèi)生致熱源如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等[2]。內(nèi)生致熱源作用于中樞體溫正性調(diào)節(jié)介質(zhì)前列腺素E2(PGE2)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)等，使得中樞介質(zhì)作用于視前區(qū)下丘腦前部的體溫正調(diào)節(jié)中樞PO/AH核，促使體溫調(diào)定點(diǎn)上升引起發(fā)熱[3]。因此，能夠抑制內(nèi)生致熱源和中樞體溫正性調(diào)節(jié)介質(zhì)釋放的組分或藥物可能具有一定的解熱作用[4]。

毛萼香茶菜[Isodoneriocalyx(Dunn.) Hara]系唇形科香茶菜屬多年生草本或灌木植物，常被稱為火麻根、黑頭草、虎尾草等[5]。毛萼香茶菜的根、葉均可入藥，民間常將其葉直接或曬干用于治療香港腳，其根洗凈曬干用于止瀉止痢[6]。已報(bào)道的主要化學(xué)成分為對映-貝殼杉烷型四環(huán)二萜、五環(huán)三萜和黃酮類[7-8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，毛萼香茶菜具有抗腫瘤、抗炎、抗菌和抗病毒[9-11]等多種活性。以毛萼香茶菜乙醇提取物為主的清熱利咽片已上市，用于治療風(fēng)熱上擾型急性咽炎引起的咽痛，具有良好的市場前景。但目前關(guān)于該產(chǎn)品的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及機(jī)制尚未闡明。為探究其活性物質(zhì)，本課題組前期從毛萼香茶菜中分離獲得類型不同且含量較高的迷迭香酸、薊黃素和毛萼晶D。其中，迷迭香酸是一種酚酸類化合物，具有較好的抗炎、抗菌、抗病毒等活性[12]。毛萼晶D屬于對映-貝殼杉烷二萜，為毛萼香茶菜中較特有的成分。薊黃素為黃酮類成分，具有抗氧化、抑菌消炎等活性[13]。故本研究在前期研究基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，以毛萼香茶菜醇提物、薊黃素、毛萼晶D和迷迭香酸作為研究對象，探究毛萼香茶菜清咽利喉片發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)及相關(guān)機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

毛萼香茶菜醇提物(昆明生達(dá)制藥有限公司，批號20170213);毛萼晶D、迷迭香酸和薊黃素(實(shí)驗(yàn)室自制，面積歸一化法純度>98%)；撲熱息痛(國藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司)；PBS緩沖液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；大鼠血清TNF-α ELISA試劑盒、大鼠血清AVPELISA試劑盒、大鼠組織AVPELISA試劑盒、大鼠組織cAMPELISA試劑盒、大鼠組織PGE2 ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；安琪高活性酵母(安琪酵母股份有限公司)。

1.2 儀 器

全波長多功能酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；超速控溫離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電子體溫計(jì)(江蘇先聲再康藥業(yè)有限公司)；電子天平(瑞士Mettler Tolerdo公司)。

1.3 動 物

SPF級SD大鼠，雄性，180～220 g，購自江蘇省南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2014-0001。大鼠于江蘇省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，動物飼養(yǎng)條件：12 h光照循環(huán)，溫度為(24±2) ℃，相對濕度(60±10)%，自由進(jìn)食和飲水。

2 方 法

2.1 藥物的配制

準(zhǔn)確稱量毛萼香茶菜醇提物、迷迭香酸、薊黃素、毛萼晶D和陽性藥撲熱息痛，用0.5%的CMC-Na配制所需濃度的混懸液。準(zhǔn)確稱量干酵母，用生理鹽水配制15%的酵母混懸液。配制好的藥物均置于4 ℃冰箱保存，其中酵母混懸液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 大鼠發(fā)熱模型的建立和給藥治療

2.2.1 適應(yīng)性操作 正式實(shí)驗(yàn)前3天，每天用體溫計(jì)間隔1 h測量肛溫2次，使其適應(yīng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的肛溫測定操作，減少后續(xù)實(shí)驗(yàn)體溫波動對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 剔除前3天間隔2次測量肛溫超過38 ℃或者2次測量值相差大于0.5 ℃的大鼠。將剩余大鼠隨機(jī)分為8組，分別為空白組(Blank)、模型組(Model)、陽性藥組(Paracetamol)、醇提物低劑量組(XCC-L)、醇提物高劑量組(XCC-H)、迷迭香酸組(ME-1)、薊黃素組(ME-2)、毛萼晶D組(ME-3)。

2.2.3 測定基礎(chǔ)體溫 禁食不禁水12 h，用手抓住大鼠背部皮毛，輕輕按住大鼠背部，使其固定在鼠籠的鐵蓋子上，使電子溫度計(jì)探頭涂以石蠟插入大鼠直腸3 cm處，間隔1 h連續(xù)2次測量肛溫作為基礎(chǔ)體溫。

2.2.4 制備發(fā)熱模型 空白組動物皮下注射0.9%的生理鹽水，其余組的大鼠分別背部皮下注射15%的酵母菌混懸液，造模4 h后測定大鼠肛溫。

2.2.5 給藥 測定肛溫完畢后，予以藥物治療，空白組和模型組灌胃0.5%的CMC-Na，陽性藥組給藥劑量為150 mg/kg，毛萼香茶菜醇提物低高劑量組分別為200、800 mg/kg，迷迭香酸組、薊黃素組和毛萼晶D組給藥劑量均為150 mg/kg，各組給藥體積均為10 mL/kg。

2.3 體溫測定

藥物治療后，每次間隔1 h測定大鼠肛溫，連續(xù)測定4次，分別記錄每次測定的肛溫。

2.4 動物血清收集及組織取材

發(fā)熱高峰期(造模8 h)，眼眶后靜脈叢取血，置于EP管中靜置，3 000 r/min 離心20 min，吸取適量上清液置于EP管中，置于4 ℃冰箱保存待測，其余上清液置于-80 ℃冰箱保存。

實(shí)驗(yàn)大鼠取血后，頸椎脫臼處死，迅速取出全腦，冰浴下取大鼠下丘腦和腦腹中隔區(qū)腦組織，存放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測。大鼠下丘腦50 mg，加入一定量PBS緩沖液(腦組織與PBS緩沖液比例為1∶9)冰浴中充分勻漿，然后3 000 r/min離心30 min，收集上清置于EP管中，4 ℃冰箱保存待測，其余上清液置于-80 ℃冰箱保存。

2.5 血清精氨酸加壓素(AVP)和腫瘤壞死因子(TNF-α)含量測定

血清按照“2.4”項(xiàng)步驟處理后，依照對應(yīng)的ELISA試劑盒說明書的步驟進(jìn)行檢測。

2.6 下丘腦環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、前列腺素E2(PGE2)和腦腹中隔區(qū)(VSA)精氨酸加壓素(AVP)含量測定

組織按照“2.4”項(xiàng)步驟處理后，依照對應(yīng)的EILSA試劑盒說明書的步驟進(jìn)行檢測。

2.7 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié) 果

3.1 體溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，與空白組相比，各組大鼠在皮下注射酵母混懸液4 h后，肛溫顯著上升(P<0.01)，說明發(fā)熱模型構(gòu)建成功。皮下注射酵母菌混懸液4h后，各給藥組與模型組比較，肛溫?zé)o顯著性差異，說明各給藥組與模型組的肛溫平行性較好，為藥效學(xué)的考察提供了較好的前提條件。給藥1、2、3 和4 h后，與空白組相比，模型組肛溫顯著升高(P<0.01)，說明發(fā)熱模型穩(wěn)定，且模型組動物肛溫的變化趨勢與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14-16]。與模型組相比，Paracetamol組在給藥1、2、3 和4 h內(nèi)肛溫顯著下降(P<0.01)，說明陽性藥撲熱息痛能夠明顯抑制肛溫的上升；與模型組相比，XCC-L組在給藥1和2 h 后，肛溫呈下降趨勢，但無顯著性差異，給藥3 h和4 h后，肛溫顯著下降(P<0.05)。XCC-H組在給藥1 h后，肛溫?zé)o顯著性差異，在給藥2、3 和4 h后，與模型組相比能夠明顯降低發(fā)熱動物的肛溫(P<0.05)。此外，ME-1和ME-2組在給藥1h后，與模型組相比能明顯降低發(fā)熱動物的肛溫(P<0.01、P<0.05)，但給藥2、3 和4 h后，肛溫均無顯著性差異。而ME-3組在給藥后1～4 h之間，肛溫均未見顯著性差異，提示毛萼晶D無解熱作用。

Table 1 Antipyretic effects of ethanol extract of Isodon eriocalyx (XCC) and related compounds on rectal temperature in the rats induced by dry yeast

3.2 生化指標(biāo)結(jié)果

3.2.1 血清TNF-α含量測定 如圖1-A所示，與空白組相比，模型組大鼠血清TNF-α的水平顯著升高(P<0.01)，說明發(fā)熱模型構(gòu)建成功；與模型組相比，Paracetamol、XCC-L和XCC-H組血清TNF-α含量顯著降低(P<0.01、P<0.05、P<0.01)，說明陽性藥撲熱息痛、醇提物低、高劑量組均能夠通過降低大鼠血清炎癥因子TNF-α的水平來發(fā)揮解熱作用。與模型組相比，ME-1、ME-2和ME-3組大鼠的血清TNF-α含量呈下降趨勢，但均無顯著性差異，提示迷迭香酸、薊黃素和毛萼晶D均不能通過降低血清TNF-α的水平發(fā)揮解熱作用。

3.2.2 血清AVP含量測定 如圖1-B所示，與空白組相比，模型組大鼠血清AVP含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，XCC-H組能夠顯著升高血清AVP含量(P<0.05)，說明醇提物高劑量組能夠促進(jìn)內(nèi)源性AVP釋放來抑制發(fā)熱。而其余各組大鼠血清AVP含量與模型組相比，均未見顯著性差異，提示醇提物低劑量、迷迭香酸、薊黃素和毛萼晶D均不能夠影響血清AVP的分泌。

Figure 1 Effects of XCC and related compounds on the serum levels of TNF-α and arginine vasopressin (AVP) in fever rats induced by subcutaneous injection dry yeast

3.2.3 腦腹中隔區(qū)AVP含量測定 如圖2所示，與空白組相比，模型組大鼠腦腹中隔區(qū)AVP含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，Paracetamol、XCC-L、XCC-H組均能夠顯著降低AVP含量(P<0.01)，說明陽性藥、醇提物低、高劑量組均能夠促進(jìn)內(nèi)源性AVP釋放來發(fā)揮解熱作用。與模型組相比，ME-1、ME-2和ME-3組大鼠的腹中隔區(qū)AVP含量呈下降趨勢，但均無顯著性差異，提示迷迭香酸、薊黃素和毛萼晶D均不能夠影響腹中隔AVP的釋放。

Figure 2 Effects of XCC and related compounds on the VSA levels of AVP in fever rats induced by subcutaneous injection dry yeast

3.2.4 下丘腦cAMP含量測定 如圖3-A所示，與空白組相比，模型組大鼠下丘腦cAMP含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，Paracetamol、XCC-L、XCC-H組均能夠顯著降低下丘腦cAMP含量(P<0.01、P<0.01、P<0.05)，說明陽性藥撲熱息痛、醇提物低、高劑量都能夠通過抑制下丘腦分泌cAMP來抑制發(fā)熱。與模型組相比，ME-1、ME-2和ME-3組大鼠的下丘腦cAMP含量呈下降趨勢，但均無顯著性差異，提示迷迭香酸、薊黃素和毛萼晶D均不能夠影響下丘腦cAMP的分泌。

3.2.5 下丘腦PGE2含量測定 如圖3-B所示，與空白組相比，模型組大鼠的下丘腦PGE2含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Paracetamol、XCC-L、XCC-H組均能夠顯著降低下丘腦PGE2含量(P<0.05)，說明陽性藥撲熱息痛、醇提物低、高劑量均能夠通過抑制下丘腦分泌PGE2來發(fā)揮解熱作用。與模型組相比，ME-1、ME-2和ME-3組大鼠的下丘腦PGE2含量呈下降趨勢，但均無顯著性差異，提示迷迭香酸、薊黃素和毛萼晶D均不能夠影響下丘腦PGE2的分泌。

Figure 3 Effects of XCC and related compounds on the hypothalamus levels of cAMP and PGE2 in fever rats induced by subcutaneous injection dry yeast

4 討 論

發(fā)熱是由于外生致熱源(脂多糖、細(xì)菌、病毒等)進(jìn)入機(jī)體，作用于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞，產(chǎn)生內(nèi)源性致熱原(IL-1β、TNF-α等)直接或間接通過中樞介質(zhì)(PGE2、cAMP、AVP等)作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，導(dǎo)致體溫調(diào)定點(diǎn)上移，產(chǎn)熱增加，散熱減少引起的。目前發(fā)熱實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某Ｓ迷炷┯兄嗵恰?,4-二硝基酚、啤酒酵母等[17]。脂多糖造模用量極其微量，計(jì)量不易配制準(zhǔn)確，劑量高則會引發(fā)動物死亡；2,4-二硝基酚誘導(dǎo)的動物發(fā)熱持續(xù)時(shí)間較短，不適用于作用緩慢而持久的藥物篩選；皮下注射干酵母誘發(fā)的發(fā)熱模型穩(wěn)定，例如開始發(fā)熱時(shí)間、發(fā)熱達(dá)到的最高溫度及發(fā)熱持續(xù)時(shí)間均比較固定，是評價(jià)中藥提取物以及中藥復(fù)方解熱作用最常用的模型，故本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射干酵母誘導(dǎo)動物發(fā)熱造模[18-19]。

外生致熱源通過刺激機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)生致熱源進(jìn)而影響體溫調(diào)節(jié)中樞介質(zhì)的分泌，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，從而使機(jī)體產(chǎn)熱增加，散熱減少誘發(fā)機(jī)體發(fā)熱。因此，抑制內(nèi)生致熱源的產(chǎn)生、或抑制中樞正性調(diào)節(jié)介質(zhì)的釋放、或促進(jìn)中樞負(fù)性調(diào)節(jié)介質(zhì)的釋放都能夠阻斷發(fā)熱環(huán)節(jié)而抑制發(fā)熱。故本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)生致熱源和中樞的正負(fù)性調(diào)節(jié)介質(zhì)作為評價(jià)指標(biāo)來探討毛萼香茶菜醇提物和相關(guān)單體成分的解熱機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，毛萼香茶菜醇提物對干酵母誘導(dǎo)的SD大鼠發(fā)熱具有顯著的解熱作用。但從醇提物中獲得含量相對較高的單體化合物解熱作用不明顯，可能是由于醇提物的成分復(fù)雜，其解熱藥效是通過多組分協(xié)同實(shí)現(xiàn)的，這也與中藥多組分、多靶點(diǎn)、多通路從而整體協(xié)同發(fā)揮作用的特點(diǎn)一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛萼香茶菜醇提物能夠顯著降低大鼠血清TNF-α的含量，提示其解熱作用與降低內(nèi)生致熱源TNF-α的分泌有關(guān)；毛萼香茶菜醇提物能夠顯著降低腦腹中隔區(qū)AVP含量，升高血漿中AVP含量，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，說明毛萼香茶菜醇提物發(fā)揮解熱作用與促進(jìn)內(nèi)源性AVP的釋放有關(guān)；毛萼香茶菜醇提物能夠顯著降低下丘腦組織中cAMP、PGE2的含量，提示其解熱機(jī)制與抑制下丘腦cAMP、PGE2分泌有關(guān)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過皮下注射酵母菌構(gòu)建動物發(fā)熱模型，研究結(jié)果顯示毛萼香茶菜醇提物具有解熱作用，且具有起效時(shí)間慢、作用時(shí)間長的特點(diǎn)。其解熱機(jī)制可能是通過抑制內(nèi)生致熱源TNF-α的分泌，進(jìn)而抑制中樞正性調(diào)節(jié)介質(zhì)cAMP、PGE2的分泌，促進(jìn)內(nèi)源性AVP的釋放發(fā)揮解熱作用；也有可能分別抑制內(nèi)生致熱源TNF-α、抑制中樞正性調(diào)節(jié)介質(zhì)cAMP和PGE2的分泌而發(fā)揮解熱作用。但其藥效物質(zhì)還需從不同成分類型、協(xié)同作用等方面開展深入研究，本文研究結(jié)果為初步探究毛萼香茶菜解熱作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。