黃冠予 彭昊* 劉陽 張雷 梁世博

股骨頭缺血性壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是一種常見的難治性骨科疾病。ONFH可大致分為兩類：一類為創(chuàng)傷引起的股骨頭缺血性壞死，稱為創(chuàng)傷性O(shè)NFH；另一類為非創(chuàng)傷因素引起的股骨頭缺血性壞死，稱為非創(chuàng)傷性O(shè)NFH。其中，創(chuàng)傷性O(shè)NFH的發(fā)病原因通常較為明確，大多是因?yàn)橥鈧鸬墓晒穷^滋養(yǎng)血管（尤其是旋股內(nèi)側(cè)動(dòng)脈）受損，引起股骨頭血供不足，導(dǎo)致股骨頭中骨細(xì)胞缺血性壞死。非創(chuàng)傷性O(shè)NFH的發(fā)病原因則通常比創(chuàng)傷性O(shè)NFH復(fù)雜，大致包括以下原因：長(zhǎng)期或大劑量使用糖皮質(zhì)激素；大量飲酒；肥胖；血液系統(tǒng)疾?。粷撍。活愔|(zhì)增生；血管疾??；結(jié)締組織??；腎移植；急性胰腺炎。其中，長(zhǎng)期或大劑量使用糖皮質(zhì)激素和酗酒是非創(chuàng)傷性O(shè)NFH最主要、最常見的兩個(gè)發(fā)病原因。

目前，糖皮質(zhì)激素作為治療某些自身免疫性疾?。ㄈ缒I病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等）的有效手段，其使用率在不斷增長(zhǎng)，因此導(dǎo)致了糖皮質(zhì)激素引起的ONFH的患者數(shù)量不斷增多[1-2]。長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素治療的患者9%～40%會(huì)發(fā)生激素性骨壞死（glucocorticoidinducedosteonecrosis，GIO），而短期大劑量的糖皮質(zhì)激素的暴露也會(huì)發(fā)生骨壞死[3-4]。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭缺血性壞死的病理機(jī)制十分復(fù)雜，受到廣泛認(rèn)同的觀點(diǎn)包括：脂質(zhì)代謝紊亂；血液循環(huán)障礙；髓內(nèi)壓升高；凝血纖溶系統(tǒng)障礙；微血管內(nèi)皮損傷；細(xì)胞功能障礙；細(xì)胞凋亡[5-9]。地塞米松作為糖皮質(zhì)激素中的代表藥物，被廣泛用于臨床治療及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中。現(xiàn)今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重心逐漸集中于細(xì)胞凋亡學(xué)說。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，激素性O(shè)NFH的病理進(jìn)程中包含了成骨細(xì)胞的凋亡。而且激素性 ONFH的實(shí)質(zhì)并非是骨細(xì)胞的壞死，而是表現(xiàn)為成骨細(xì)胞的顯著凋亡[10-12]。在激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡過程中，氧化損傷要早于骨壞死，使用激素后，很快就會(huì)出現(xiàn)氧化損傷。糖皮質(zhì)激素會(huì)使得小鼠骨組織內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增加[13]。LinH和SatoAY等學(xué)者[14-15]的研究也證實(shí)，ROS與激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡具有緊密的聯(lián)系。

黃嘌呤氧化酶（xanthineoxidase，XOD）是一種底物專一性低，并且廣泛存在于各類動(dòng)物組織細(xì)胞的酶。其主要作用包括：參與機(jī)體內(nèi)核酸的分解代謝；促進(jìn)鐵的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)；檢查超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）的活性；產(chǎn)生氧自由基。黃嘌呤氧化酶是大多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS的主要來源之一。在外界壓力增大的情況下，XOD活性增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS增多，ROS的劇烈增多導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)損傷的發(fā)生及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外研究表明，XOD高表達(dá)和活性增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的ROS增加，從而導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡[16-18]。但從現(xiàn)有文獻(xiàn)看，對(duì)XOD和細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究大多集中在心肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞領(lǐng)域。并未有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)在激素性成骨細(xì)胞凋亡過程中XOD所起到的作用以及具體的信號(hào)傳導(dǎo)通路。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探究在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的病理過程中，XOD的具體作用以及作用機(jī)制。并通過使用XOD的特異性抑制劑別嘌醇進(jìn)行干預(yù)，以期闡述具體的信號(hào)調(diào)控通路以及調(diào)控機(jī)制，尋找到新方法治療ONFH。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1），由中科院細(xì)胞庫提供。主要試劑包括：胎牛血清（Serapro公司）、別嘌醇（Selleck公司）、地塞米松（Sigma公司）、STAT-1抗體（Sigma公司）、Caspase-3抗體（Sigma公司）、Bcl-2抗體（Sigma公司）、Bax抗體（Sigma公司）、細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)試劑盒（紅色熒光，Sigma公司）、黃嘌呤氧化酶試劑盒（Sigma公司）、JC-1試劑盒（Sigma公司）、MDA試劑盒（Sigma公司）。

地塞米松（Dexamethasone，DEX）原液：25 mg DEX粉末加入25 mL無水乙醇中混勻。

1 mg/mL別嘌醇原液：25 mg別嘌醇粉末加入25 mL PBS溶解混勻。

5mol/L別嘌醇DEX培養(yǎng)基：34L別嘌醇原液與15 mL的110-6mol/L DEX培養(yǎng)基混勻。

10 mol/L別嘌醇DEX培養(yǎng)基：68 L別嘌醇原液與15 mL的110-6mol/L DEX培養(yǎng)基混勻。

15mol/L別嘌醇DEX培養(yǎng)基：102L別嘌醇原液與15 mL的110-6mol/L DEX培養(yǎng)基混勻。

1.2 激素性成骨細(xì)胞凋亡模型的建立

1.3 CCK-8試劑盒

使用 CCK-8試劑盒檢測(cè)在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的條件下，加入不同濃度的別嘌醇時(shí)，細(xì)胞存活百分比。藥物濃度分別選取 0、3、5、7、10、13、15、20 mol/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法

1.5 生化指標(biāo)測(cè)定

通過 CCK-8試劑盒檢測(cè)合適的干預(yù)藥物濃度。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況以及細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度。全自動(dòng)熒光顯微鏡拍攝細(xì)胞內(nèi)ROS熒光照片，并測(cè)算平均熒光密度。Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)XOD、MDA以及線粒體膜電位（mitochondrialmembrane potential，MMP）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用單因素ANOVA分析進(jìn)行多組數(shù)據(jù)之間的比較，多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較則使用Bonferroni法校正檢驗(yàn)結(jié)果。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力

CCK-8試劑盒的檢測(cè)結(jié)果顯示，在DEX誘導(dǎo)凋亡的背景下，別嘌醇藥物濃度小于5 mol/L時(shí)，沒有顯著的保護(hù)作用。當(dāng)別嘌醇藥物濃度大于5 mol/L且小于15 mol/L時(shí)，細(xì)胞存活率隨著藥物濃度增加而增加。當(dāng)別嘌醇濃度超過15 mol/L時(shí)，細(xì)胞存活率無明顯增高。根據(jù)CCK-8試劑盒各組吸光度結(jié)果，測(cè)算出各組細(xì)胞存活率后，用 GraphPad Prism-5軟件制作曲線圖并測(cè)算半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50%of maximal effect，EC50），得出的EC50值為8.898mol/L，因此本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度梯度為5 mol/L、10 mol/L和15 mol/L，見圖1。

圖1 在DEX誘導(dǎo)凋亡的背景下，不同別嘌醇濃度時(shí)的MC3T3-E1細(xì)胞活力

2.2 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡情況

結(jié)果顯示，在凋亡細(xì)胞占比方面，空白組為（5.96±0.446）%，模 型 組 為（12.86±1.671）%，5 mol/L 組 為（8.94±0.340）%，10 mol/L組為（7.94±0.079）%，15 mol/L組為（6.88±0.129）%。通過單因素ANOVA分析，發(fā)現(xiàn)空白組與模型組、5 mol/L組、10 mol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而空白組與15 mol/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.192）。模型組與空白組以及其他各干預(yù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 A.空白組；B.模型組；C.5 mol/L組；D.10 mol/L組；E.15 mol/L組（n=6）

2.3 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度

結(jié)果顯示，空白組ROS平均熒光強(qiáng)度為（16618.33±817.377）；模型組ROS平均熒光強(qiáng)度為（39 449.67±1 532.136）；5 mol/L組ROS平均熒光強(qiáng)度為（32688.33±1484.619）；10 mol/L組ROS平均熒光強(qiáng)度為（28091.00±1434.407）；15 mol/L組ROS平均熒光強(qiáng)度為（23639.67±1221.545）?？瞻捉M與其他各組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過Bonferroni法校正，兩兩對(duì)比結(jié)果顯示各組細(xì)胞內(nèi)ROS的平均熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖3）。

圖3 A.各組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度分布圖（n=6）；B.各組細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度（P＜0.05，n=6）。**代表與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

2.4 熒光顯微鏡檢測(cè)ROS熒光平均光密度

通過熒光顯微鏡對(duì)各組細(xì)胞的細(xì)胞爬片進(jìn)行拍照記錄，通過計(jì)算細(xì)胞ROS熒光平均光密度對(duì)比各組細(xì)胞中ROS含量。通過 ImageJ軟件分析，空白組 ROS平均光密度為（0.052±0.0020），模型組 ROS 平均光密度為（0.130±0.0040），5 mol/L組ROS平均光密度為（0.093±0.0015），10 mol/L組ROS平均光密度為（0.077±0.0025），15mol/L組ROS平均光密度為（0.063±0.0025）。通過單因素ANOVA分析，空白組的ROS平均光密度與其他各組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組間進(jìn)行兩兩比較，各組的平均光密度數(shù)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 A.各組細(xì)胞的ROS熒光照片，由左至右分別為整合圖、ROS熒光圖和未氧化的二氫乙啶熒光圖；B.各組細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光密度。**代表與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

2.5 Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，模型組與空白組相比促凋亡蛋白明顯表達(dá)增加，如Caspase-3、STAT-1、Bax，而抗凋亡蛋白Bcl-2明顯降低，通過單因素 ANOVA分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5 mol/L組、10 mol/L組、15 mol/L組與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著別嘌醇濃度的增加，STAT-1、Caspase-3和 Bax的表達(dá)量逐漸下降，而Bcl-2的表達(dá)量顯著上升（見圖5）。

圖5 A.各組細(xì)胞Western Blot蛋白條帶圖（n=6）；B.各組細(xì)胞中STAT-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的蛋白印跡灰度值與內(nèi)參蛋白GADPH灰度值的比值（n=6）。**代表與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

2.6 黃嘌呤氧化酶試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)黃嘌呤氧化酶（XOD）表達(dá)

結(jié)果顯示，空白組的 OD值為（0.161±0.0113）A，模型組的OD值為（0.243±0.0144）A，5mol/L組的OD值為（0.166±0.0174）A，10 mol/L 組的OD值為（0.138±0.0150）A，15mol/L組的 OD 值為（0.113±0.0125）A。單因素ANOVA分析結(jié)果表明模型組與空白組進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），通過兩兩比較發(fā)現(xiàn)，空白組和5 mol/L組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，5 mol/L組和10 mol/L組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05），其他各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖6）。

2.7 JC-1試劑盒檢測(cè)MMP

結(jié)果顯示，空白組JC-1陽性細(xì)胞比例為（4.76±0.633）%，模型組JC-1陽性細(xì)胞比例為（15.31±1.262）%，5 mol/L組 JC-1陽性細(xì)胞比例為（9.16±0.419）%，10 mol/L組JC-1陽性細(xì)胞比例為（8.11±0.577）%，15 mol/L組 JC-1陽性細(xì)胞比例為（7.57±0.631）%。通過單因素ANOVA分析，模型組與空白組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)各個(gè)別嘌醇干預(yù)組與模型組和空白組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。可見在模型組中JC-1陽性細(xì)胞比例顯著上升，即MMP降低的細(xì)胞所占比例明顯上升。隨著別嘌醇的濃度增高，JC-1陽性細(xì)胞比例有所降低，但仍高于空白組（見圖7A）。各組 FL2陽性細(xì)胞與 FL1陽性細(xì)胞的比值（見圖7B），通過單因素ANOVA分析，空白組、模型組與各別嘌醇干預(yù)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。別嘌醇干預(yù)組組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05）。

圖6 各組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)XOD的OD值（n=6）。**代表與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

圖7 A.右上象限代表FL1陽性細(xì)胞（即JC-1陽性細(xì)胞），右下象限代表FL2陽性細(xì)胞（即JC-1陰性細(xì)胞）（n=6）；B.各組FL2陽性細(xì)胞與FL1陽性細(xì)胞的比值（n=6）。**代表與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

2.8 MDA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用

本實(shí)驗(yàn)中，空白組MDA含量為（1.18±0.126）nmol/mL，模型組 MDA 含量為（4.47±0.277）nmol/mL，5 mol/L 組MDA含量為（3.24±0.192）nmol/mL，10 mol/L組MDA含量為（2.29±0.297）nmol/mL，15mol/L 組 MDA 含量為（2.19±0.185）nmol/mL。通過單因素ANOVA分析，模型組細(xì)胞內(nèi) MDA含量與其他各組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。10 mol/L組與15 mol/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05）。其他各組間進(jìn)行兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖 8）。

圖8 各組MC3T3-E1細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)MDA含量（n=6）。**代表與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡是激素性 ONFH的病理實(shí)質(zhì)，但因其細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路十分復(fù)雜，因此仍舊是研究的熱點(diǎn)。在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的病理過程中，氧化應(yīng)激損傷、黃嘌呤氧化酶、ROS是否參與到了病理過程以及是否促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，至今仍未被明確闡述。在本次實(shí)驗(yàn)中，干預(yù)組加入了不同劑量的別嘌醇，目的是抑制細(xì)胞中XOD的活性，減少M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，降低 MC3T3-E1細(xì)胞所受到的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡比例。XOD是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來源之一，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激損傷時(shí)，細(xì)胞通過半胱氨酸殘基介導(dǎo)的可逆性氧化或Ca2+介導(dǎo)的不可逆性氧化途徑使得蛋白質(zhì)水解，使得更多的黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase，XDH）轉(zhuǎn)變?yōu)閄OD，而XOD在參與細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)時(shí)，會(huì)將電子轉(zhuǎn)移至氧分子上，從而產(chǎn)生大量ROS[19]。

本實(shí)驗(yàn)中使用別嘌醇抑制XOD后，細(xì)胞凋亡比例與模型組相比明顯降低，說明抑制XOD活性可以抑制DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞內(nèi)ROS含量方面，模型組ROS熒光強(qiáng)度以及平均光密度明顯高于其余各組，表明在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的 MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的過程中，細(xì)胞內(nèi)ROS濃度明顯增加，而抑制XOD活性后，可以減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和積累，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。在使用不同劑量別嘌醇干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度以及平均光密度顯著降低，細(xì)胞凋亡比例也有所降低。再次說明XOD和ROS均參與了激素性成骨細(xì)胞凋亡的病理過程，并且有促凋亡的作用；而通過抑制細(xì)胞內(nèi)XOD的活性，可以減少M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而減少細(xì)胞凋亡的比例。在 Guo F等學(xué)者對(duì) HCT116細(xì)胞凋亡過程的研究中發(fā)現(xiàn)，ROS通過誘導(dǎo)MMP降低，使線粒體膜通透性增加并且增加Caspase-3、Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程[20]。Lee MH等學(xué)者[21]的研究也表明ROS可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與線粒體膜通透性增高后，線粒體釋放細(xì)胞色素 C并引起下游的胱天蛋白酶（caspase）產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)中，WesternBlot的結(jié)果顯示，模型組中促凋亡蛋白STAT-1、Caspase-3和Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，而STAT-1是Caspase-3上游的調(diào)控因子，可以說明糖皮質(zhì)激素通過激活 STAT-1/Caspase-3信號(hào)通路途徑和調(diào)節(jié) Bax/Bcl-2比例來誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。結(jié)合WesternBlot的結(jié)果和JC-1檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可以通過上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，使得Bax轉(zhuǎn)位至線粒體外膜并形成多聚體孔道，造成線粒體膜通透性增加和MMP穩(wěn)態(tài)崩潰，線粒體膜間隙內(nèi)的促凋亡物質(zhì)被釋放入細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)，觸發(fā)內(nèi)源性線粒體促凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在別嘌醇干預(yù)組中STAT-1、Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)與模型組相比顯著降低，Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，說明ROS可以通過STAT-1/Caspase-3信號(hào)通路途徑以及調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比例來誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。而別嘌醇可以通過抑制過量ROS的產(chǎn)生，減少STAT-1、Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)，效果與劑量呈正相關(guān)，可以再次證明ROS是通過STAT-1/Caspase-3信號(hào)通路途徑以及調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比例來誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的。但是在不同劑量的別嘌醇干預(yù)組中，Bcl-2蛋白表達(dá)與模型組相比有所上調(diào)，但與藥物劑量未見顯著正相關(guān)聯(lián)系，可能是由于別嘌醇不是Bcl-2的特異性激動(dòng)劑，而是通過降低ROS的產(chǎn)生來降低線粒體膜的氧化應(yīng)激損傷。在 Zhong J等學(xué)者[22]對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的研究中，他們發(fā)現(xiàn)通過抑制ROS的生成可以扭轉(zhuǎn)部分細(xì)胞膜電位的降低，并且減少Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)，從而抑制SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。另一項(xiàng)對(duì)表柔比星誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的研究中也表明，過量的ROS可以通過上調(diào)Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)導(dǎo)致成骨細(xì)胞通過內(nèi)源性線粒體途徑凋亡[23]。

本次實(shí)驗(yàn)中，模型組中細(xì)胞XOD的活性明顯高于其他各組，且氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度也顯著高于其他各組，說明XOD和氧化應(yīng)激反應(yīng)參與到了該病理過程中。XOD在此過程中產(chǎn)生大量ROS，并且超出細(xì)胞自身清除ROS的能力范圍，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。從別嘌醇干預(yù)組的結(jié)果來看，加入特異性XOD抑制劑別嘌醇可以有效地抑制XOD的活性，減少ROS的產(chǎn)生并降低氧化應(yīng)激損傷，從而減少由ROS介導(dǎo)的線粒體途徑細(xì)胞凋亡。結(jié)合MMP檢測(cè)結(jié)果來看，在此過程中MMP下降并失穩(wěn)，說明在此過程中ROS起到關(guān)鍵的作用，ROS通過介導(dǎo)對(duì)線粒體的氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致線粒體膜通透性增高和膜電位穩(wěn)態(tài)失衡。通過別嘌醇干預(yù)，MMP降低細(xì)胞占比有所減少。其原因可能是因?yàn)檫^量ROS是導(dǎo)致MMP崩潰的主要誘因，而別嘌醇可以減少ROS的生成，從而減少線粒體的氧化應(yīng)激損傷。在LiK等學(xué)者的研究中，使用ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸可以顯著減少硝普鈉誘導(dǎo)的椎間盤髓核細(xì)胞的凋亡，其原理是通過清除ROS使得MMP恢復(fù)穩(wěn)定，從而減少內(nèi)源性線粒體途徑所致的細(xì)胞凋亡[24]。在Jacob S等學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn)，使用特異性XOD抑制劑非布司他可以有效抑制氣管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，顯著降低細(xì)胞內(nèi)XOD活性，減少ROS和MDA的含量[25]。

4 結(jié)論

XOD在激素性成骨細(xì)胞凋亡的病理過程中，產(chǎn)生過量的 ROS，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，并通過激活 STAT-1和Bax來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且還可以導(dǎo)致MMP穩(wěn)態(tài)崩潰誘發(fā)內(nèi)源性線粒體凋亡途徑。而別嘌醇可以特異性地抑制 XOD的活性，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，減少STAT-1、Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)，使細(xì)胞MMP穩(wěn)態(tài)恢復(fù)，從而減少成骨細(xì)胞凋亡。