席 穎 劉慧剛 袁 喜 張棟棟 任 東 黃應(yīng)平

(1.三峽大學(xué) 水利與環(huán)境學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.湖北省農(nóng)田環(huán)境監(jiān)測工程技術(shù)中心，湖北 宜昌443002；3.三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心(三峽大學(xué))，湖北 宜昌 443002)

石油產(chǎn)品是復(fù)雜的烴類混合物，含有多環(huán)芳烴等有毒化合物[1].柴油作為一種典型的石油類碳?xì)浠衔?，對動物和人體健康構(gòu)成威脅，對環(huán)境造成嚴(yán)重危害[2].因此，去除環(huán)境中柴油污染物成為一項亟待解決的事情.植物修復(fù)作為一項綠色環(huán)保的技術(shù)，其修復(fù)效率跟植物生長狀況密切相關(guān)，植物生長狀態(tài)越好，植物修復(fù)效率越高[3].植物的光合熒光特性是評價植物光合作用的重要指標(biāo)，植物光合作用越強(qiáng)，植物生長狀況越好，具有的植物修復(fù)潛能更大.污染土壤中的石油類碳?xì)浠衔镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)是限制植物生長的重要因素，研究表明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的柴油會對植物葉肉細(xì)胞葉綠素造成損傷，從而抑制植物光合作用，導(dǎo)致植物光合效率下降，影響植物正常生長[4].因此，需要研究一些添加物，能緩解多環(huán)芳烴對植物生長的脅迫作用，提高植物修復(fù)效率.

硒(Se)是一種有益的微量元素，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硒對生物有益.Hartikainen[5]曾對硒對黑麥草生長的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10mg/kg時對植物出現(xiàn)了毒害作用，而當(dāng)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1mg/kg時能促進(jìn)植物生長.硒能在生物體內(nèi)合成硒蛋白，硒蛋白能幫助生物清除體內(nèi)因為脅迫產(chǎn)生的氧化自由基，從而增加了生物對污染物的耐受性.很多文獻(xiàn)曾報道硒能增強(qiáng)植物在重金屬、鹽堿、干旱等脅迫下耐受性[6-8]，緩解污染物對植物生長的抑制，這些文獻(xiàn)都是集中關(guān)于硒緩解重金屬、干旱等污染物對植物脅迫的研究，關(guān)于硒對高質(zhì)量分?jǐn)?shù)柴油脅迫下植物生長影響的文獻(xiàn)報道較少.有文獻(xiàn)報道指出三葉草是一種植物修復(fù)常見植物物種，具有良好的吸收富集土壤污染物的能力[9].

本文以三葉草(Trifoliumrepens)為研究對象，通過測量三葉草在不同柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫下的光合熒光參數(shù)，來反映柴油對三葉草的光合作用的影響.通過比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)柴油脅迫下加硒與對照組三葉草光合熒光參數(shù)的差別，探討土壤加硒對于柴油脅迫下三葉草光合熒光特性的影響，以期為植物修復(fù)提供新思路和新方法.

1 材料和方法

1.1 試驗土壤和植物

供試土壤取自三峽大學(xué)植物園內(nèi)20～60cm 的土層.土壤pH，有機(jī)質(zhì)、總磷、總氮、土壤粒徑和硒的測定分別通過玻璃電極測定方法(NY/T 1377-2007)；重鉻酸鉀(NY/T1121.6-2006)；MoSb分光光度法(HJ632-2011)；凱氏定氮法(HJ717-2014)；比重法(FHZDZTR0008)；以及耦合等離子質(zhì)譜法(ICPMS，Thermo Fisher Scientific，USA)進(jìn)行.土壤pH值為7.41，有機(jī)質(zhì)2.79g/kg，土壤總磷445.1mg/kg，總氮316mg/kg，土壤砂粒、粉粒、粘粒的百分比分別為32、57、11%，土壤硒本底值為0.02mg/kg.

供試植物取自三峽大學(xué)植物園內(nèi)長勢一致三葉草幼苗，平均株高(18±0.5cm)，所有幼苗進(jìn)行3d預(yù)培養(yǎng)，然后移栽到實驗盆內(nèi)，每盆內(nèi)選4顆健康幼苗.

1.2 實驗設(shè)計

實驗盆為6L容量，每盆裝3000g過2mm 篩的細(xì)土.將柴油加入土壤中拌勻，形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，15，20，25g/kg 柴油污染土壤.再將硒(Na2SeO3)(Sigma，St.Louis，MO，USA)溶解于蒸餾水中制備硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/kg的Na2SeO3溶液加入實驗組的盆中，對照組加入等體積的蒸餾水.充分?jǐn)嚢杈鶆蛑糜陉幇堤幤胶?d.將三葉草幼苗移栽到實驗盆內(nèi).試驗盆被分為4組：無硒對照組，加硒對照組，無硒實驗組，加硒實驗組.對照組為只有柴油污染的土壤無植物.實驗組為柴油污染土壤及植物.4組試驗組包含3個柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)置3個重復(fù).試驗在戶外大棚內(nèi)進(jìn)行，實驗周期60d，實驗過程中每3d澆一次水，保持土壤持水量約70%.

1.3 試驗測定方法

在植物生長60d后，將植物從盆中小心拔出，用蒸餾水洗凈，在根莖的分界處用剪刀分開，用干凈抹布擦干，用天平分別稱量根莖的鮮重.

選取植物從上往下數(shù)第二片完全生長擴(kuò)展開的葉片，利用LI-6400XT 便攜式光合儀(Li-COR，USA)測定植物凈光合速率(Pn，μmol/m2/s1)、細(xì)胞間二氧化碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Ci，μmol/mol)、氣孔導(dǎo)度(Gs，mol/m2/s1)和蒸騰速率(Tr，mmol/m2/s1).光合參數(shù)的測定選擇在晴天的上午約9：30～11：30的時間段進(jìn)行.空氣相對濕度，二氧化碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以及光合作用光子通量密度(PPFD)分別為25℃、80%～90%、400μmol/mol和1000μmol/(m2·s-1).植物熒光參數(shù)也是采用相同的儀器，去植物從上往下數(shù)第二片完全擴(kuò)展開的葉片，在經(jīng)過30min的黑暗適應(yīng)后進(jìn)行熒光參數(shù)測定和計算最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ФPSⅡ).每盆取4片葉子計算平均值.具體測定方法參照Huang關(guān)于植物光合熒光的研究報道[10].

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個處理均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，采用SPSS17.0運用Duncan檢驗比較不同柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對光合熒光參數(shù)影響的差別.運用Turkey檢驗來比較加硒和不加硒的區(qū)別.P＜0.05視為有顯著性差異.采用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖.

2 結(jié) 果

2.1 加硒對三葉草生長的影響

60d后，對三葉草根莖的鮮重進(jìn)行稱量，稱量結(jié)果見表1，三葉草在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)柴油脅迫下，植物的生長受到明顯的抑制.植物莖鮮重在3個不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)柴油脅迫下顯著降低(P＜0.05)，根的鮮重在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20、25g/kg時顯著高于其在稍低質(zhì)量分?jǐn)?shù)時的根重(P＜0.05).莖和根的最大抑制率分別在最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)處為55.3%和74.3%.由表1可知，植物處于最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)柴油脅迫下根莖質(zhì)量比最低，顯示高質(zhì)量分?jǐn)?shù)柴油會對植物生長產(chǎn)生顯著的脅迫.然而，加硒顯著改善了柴油對三葉草的脅迫，加硒后，植物根莖鮮重得到顯著改善(P＜0.05)，在15、20、25g/kg莖鮮重較不加硒對照組分別提高了5.8%、28.9%、28.9%，根鮮重提高了18.8%、36.2%、59.4%.加硒顯著提高了根莖質(zhì)量比，在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25g/kg時提高了43%.

表1 硒對植物根莖鮮重及跟莖鮮重比的影響

2.2 加硒對三葉草光合特性的影響

如圖1所示，三葉草光合參數(shù)除了Ci外，Pn、Gs和Tr都隨著柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈顯著降低的趨勢(P＜0.05).

試驗結(jié)果表明：三葉草光合特性收到柴油的抑制.Pn、Gs和Tr在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20g/kg時下降的最快；最低值均在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高25g/kg時.而Ci隨著柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度的增加不斷增加，在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15g/kg時顯著增加(P＜0.05)，在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20，25g/kg時無顯著性差異.加硒后，Pn、Gs和Tr相對于對照組得到了顯著改善(P＜0.05).相對于不加硒的對照組，Pn 顯著增加了49%、48%、18%、21%；Gs顯著增加了24%、32%、32%、31%；Tr增加了14%、31%、11%、6%.Ci加硒后相對于不加硒組降低，但減少并不顯著.

2.3 加硒對三葉草葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

如圖2所示，柴油脅迫下三葉草葉綠素?zé)晒馓匦跃l(fā)生了顯著的變化.Fv/Fm、qP、ФPSⅡ隨著柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加顯著降低(P＜0.05)；柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20g/kg和25g/kg時Fv/Fm、qP、ФPSⅡ無顯著差異；在柴 油 質(zhì) 量 分 數(shù) 為15、20、25g/kg，F(xiàn)v/Fm、qP 和ФPSⅡ?qū)Ρ炔裼蜐舛葹?g/kg時分別降低了2.3%、3.7%、4.8%；30.1%、41.1%、53.4%；14.2%、32.7%、37.1%.qN 隨著柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度的升高呈現(xiàn)上升趨勢，且低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、15g/kg)與高質(zhì)量分?jǐn)?shù)(20、25g/kg)之間存在顯著性差異，而兩個高質(zhì)量分?jǐn)?shù)和低質(zhì)量分?jǐn)?shù)內(nèi)部差異性并不顯著(P＜0.05).然而，加硒顯著增加了Fv/Fm、qP、ФPSⅡ值，表現(xiàn)為相對于不加硒對照組，F(xiàn)v/Fm增加了4.1%、3.2%、1.4%、1.8%；qP 增 加 了11.4%、21.5%、19.2%、18.3%；ФPSⅡ增 加 了19.3%、19.6%、21.0%、14.4%.qN 表現(xiàn)為隨著柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高逐漸增加的趨勢；且低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、15g/kg)與高質(zhì)量分?jǐn)?shù)(20、25g/kg)之間存在顯著性差異，而兩個高質(zhì)量分?jǐn)?shù)和低質(zhì)量分?jǐn)?shù)內(nèi)部差異性并不顯著.加硒后，這種增加的趨勢得到控制，表現(xiàn)為相對于不加硒對照組，qP降低了1.3%、1.5%、2.1%、0.8%.

3 討論與結(jié)論

植物的生長狀況能指示植物生長環(huán)境.本研究發(fā)現(xiàn)植物的根和莖的鮮重受到柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的顯著抑制，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，抑制作用越明顯.這個結(jié)果與Zhang等人關(guān)于藨草的研究結(jié)果一致[11].有文獻(xiàn)報道指出根莖的質(zhì)量比能反映植物受到的脅迫程度，低根莖比值指示植物受到更嚴(yán)重的環(huán)境脅迫[12].植物處于最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)柴油脅迫下根莖質(zhì)量比最低，顯示高質(zhì)量分?jǐn)?shù)柴油會對植物生長產(chǎn)生顯著的脅迫，與前人研究結(jié)論一致.然而加硒有效減少了柴油對三葉草的脅迫，緩解了植物生長受抑制的狀況.硒是一種微量元素，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硒能促進(jìn)植物的生長[13]，因此在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0g/kg時，三葉草的莖和根鮮重也有增加.關(guān)于硒改善植物生長的報道很多[6，14]，主要原因可能是由于硒能保護(hù)細(xì)胞免受羥基自由基的攻擊，起到管理植物抗氧化酶系統(tǒng)的作用[15].

植物的光合作用為植物生長提供能量.光合參數(shù)能直接反應(yīng)柴油對三葉草的脅迫程度.在外界環(huán)境脅迫下，植物的光合作用也會受到影響.Ahammed[16]曾對5種植物在多環(huán)芳烴脅迫下光合作用變化做了研究，研究發(fā)現(xiàn)，菲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著抑制了植物的光合作用.在柴油脅迫下，造成植物光合作用的減弱的因素分為氣孔因素和非氣孔因素.研究指出，若隨著Pn的降低，Ci也降低，則屬于氣孔因素；若Ci隨著Pn的降低而增加則屬于非氣孔因素[17].在本試驗中，Ci隨著Pn的降低呈現(xiàn)升高的趨勢，因此三葉草光合作用減弱的原因在于非氣孔因素.高質(zhì)量分?jǐn)?shù)柴油脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的羥基自由基，羥基自由基的累積對植物細(xì)胞內(nèi)的光合組織造成了不可逆?zhèn)?，使得葉肉細(xì)胞中的氣孔擴(kuò)散阻力增強(qiáng)，植物組織細(xì)胞活性降低，非氣孔限制因素成為抑制植物光合效率的只要因素.Chaves[18]發(fā)現(xiàn)Gs的下降可能起到保護(hù)細(xì)胞作用，而硒在調(diào)控植物細(xì)胞氣孔方面扮演著重要的角色[19].植物根系在柴油作用下限制了根從土壤中吸收水分的能力，于是葉片氣孔只能關(guān)閉以減少植物體內(nèi)水分的散失來維持植物正常生長，從而降低了植物的蒸騰速率[20].當(dāng)氣孔關(guān)閉時，植物胞間二氧化碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)也就減少，植物光合所需的原料減少直接導(dǎo)致植物光合作用受到抑制.

葉綠素?zé)晒鈪?shù)常被用于描述植物光合作用過程以及光合生理狀況，能反映環(huán)境復(fù)植物光合作用的影響[21].PSII的功能受外界環(huán)境脅迫的影響很大，而影響程度的高低可以通過葉綠素光合熒光參數(shù)的變化來反映.有研究指出最大光化學(xué)效率Fv/Fm在植物正常良好生長時維持在一個穩(wěn)定值，當(dāng)植物收到脅迫時，F(xiàn)v/Fm會下降[22].這與本試驗結(jié)論一致.ФPSⅡ的減少預(yù)示著PSII開放反應(yīng)中心開放程度(qP)減弱[23].非光化學(xué)淬火(qN)通過將多余的光能轉(zhuǎn)化為熱能來保護(hù)外界環(huán)境脅迫下的植物光合組織結(jié)構(gòu).qN 的增加表明受到了來自外界的脅迫[24].在本次研究中，F(xiàn)v/Fm、ФPSⅡ和qP的減少，以及qN 的增加，都是三葉草針對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度柴油脅迫的反映.然而，硒的存在減少了Ci、qN 和增強(qiáng)的Fv/Fm、ФPSⅡ、qP、Pn、Tr和Gs，可能是由于硒保護(hù)植物重要的光合結(jié)構(gòu)-葉綠素，提高了光合能力，并增強(qiáng)了對各種環(huán)境脅迫的抵抗力.

綜上所述，柴油脅迫會導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的羥基自由基，大量的羥基自由基供給植物葉肉細(xì)胞以及破壞葉綠素，導(dǎo)致三葉草的光合熒光特性受到了抑制，使植物的生長受到抑制.而向土壤施加低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硒，能在植物體內(nèi)合成硒蛋白，保護(hù)葉肉細(xì)胞抵御羥基自由基的供給，從而增加了三葉草對柴油的耐受性，改善了三葉草光合熒光受抑制的狀況，從而促進(jìn)了三葉草的生長.本研究為豐富和補充土壤中石油烴污染的植物修復(fù)技術(shù)提供支持.