蝦頭、蝦殼抗氧化肽的分離純化及其對(duì)秀麗隱桿線蟲的抗氧化作用

王 晉，張 風(fēng)，周愛梅*，黃煒超，王淑惠，羅旭洸

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）是世界公認(rèn)的優(yōu)良養(yǎng)殖對(duì)蝦品種之一，也是目前全世界養(yǎng)殖蝦類產(chǎn)量最高的三大種類之一[1-4]，2016年我國依舊占據(jù)南美白對(duì)蝦產(chǎn)量榜首地位，年產(chǎn)量超過40萬 t。目前我國南美白對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)主要是以出口蝦仁為主，因此在對(duì)蝦加工的過程中產(chǎn)生了大量的蝦頭、蝦殼等下腳料（約占整蝦質(zhì)量的30%～40%）[5-6]。這部分副產(chǎn)物含有豐富的蛋白質(zhì)、甲殼素、不飽和脂肪酸（如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸）以及各種氨基酸和人體必需的微量元素[7-8]。此外，蝦頭中的蝦黃具有良好的風(fēng)味，并且蝦頭、蝦殼中還含有經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的甲殼質(zhì)[6]。因此，對(duì)蝦蝦頭、蝦殼是一種優(yōu)質(zhì)的資源。但目前這些副產(chǎn)物大部分用于生產(chǎn)飼料和肥料，少部分用于生產(chǎn)甲殼素、殼聚糖[9]，產(chǎn)品的附加值低，因此對(duì)其開展深加工研究是一項(xiàng)重要課題。本課題組的前期研究表明，南美白對(duì)蝦蝦頭、蝦殼的酶解液具有較強(qiáng)的抗氧化活性，因此可進(jìn)一步采用相關(guān)技術(shù)對(duì)酶解液進(jìn)行分離純化以獲得高活性和高純度的抗氧化活性肽，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[10]。目前的研究中所采用的分離純化方法所獲得的抗氧化肽的純度較低[11]，抗氧化能力較弱[12]。國內(nèi)外大多采用化學(xué)方法進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)[13-15]。因此，獲得高純度、高抗氧化活性的抗氧化肽以及采用體內(nèi)抗氧化評(píng)價(jià)模型更好地檢測(cè)抗氧化肽的活性是十分必要的。

采用老鼠或果蠅模型時(shí)，其檢測(cè)指標(biāo)多且復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長且費(fèi)用昂貴。秀麗隱桿線蟲（簡稱線蟲）（Caenorhabditis elegans）具有穩(wěn)定性好、壽命短、體型較小、短時(shí)間內(nèi)可大量繁殖等諸多優(yōu)點(diǎn)。此外，由于秀麗隱桿線蟲有60%～80%的基因與人類的相關(guān)基因具有高度保守性，因此深受廣大科研工作者的歡迎[16]。秀麗隱桿線蟲在抗氧化方面的研究也有較多報(bào)道，目前已應(yīng)用于抗衰老、延長壽命、抗氧化、毒性實(shí)驗(yàn)、脂肪代謝等研究[17]。Forno等[18]通過給N2野生型線蟲喂食干果油，發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激條件下，干果油能延長其壽命并對(duì)氧化應(yīng)激造成的損傷起保護(hù)作用。

基于此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以南美白對(duì)蝦蝦頭、蝦殼蛋白質(zhì)的風(fēng)味蛋白酶酶解液為原料，采用超濾、凝膠過濾色譜和制備液相色譜對(duì)其進(jìn)行分離純化，并以1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、還原力、氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）為跟蹤指標(biāo)，獲得純度較高的抗氧化肽制品，進(jìn)而采用秀麗隱桿線蟲模型對(duì)其體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦頭、蝦殼蛋白質(zhì)為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制，純度為68.06%。秀麗隱桿線蟲N2野生型由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)遺傳學(xué)中心提供。

超濾管 美國Millipore公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-50廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；DPPH 日本TCI公司；亞鐵氰化鉀、三氯化鐵、鐵氰化鉀 天津市大茂化學(xué)試劑公司；VC 廣州化學(xué)試劑廠；偶氮二異丁脒鹽酸鹽美國Sigma公司；水溶性VE（Trolox） 比利時(shí)Across Organics公司；乙腈 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；胰蛋白胨、技術(shù)瓊脂粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

凝膠色譜層析柱（20 mmh400 mm） 馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；FD-IPF冷凍干燥機(jī) 北京德天佑儀器有限公司；LC-8A制備液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；EnSpire酶標(biāo)儀 美國PerkinElmer公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦頭、蝦殼蛋白質(zhì)酶解液的制備

取蝦頭、蝦殼蛋白質(zhì)（在氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、料液比1∶10、提取時(shí)間100 min條件下制得，純度為68.06%），采用風(fēng)味蛋白酶酶解，酶解條件為：溫度54 ℃、時(shí)間10.5 h、pH 8、加酶量8 000 U/g。酶解完成后，將酶解物混合液置于沸水浴加熱滅酶20 min，4 000 r/min離心20 min后，收集上清液，冷凍干燥后即得酶解物，－20 ℃條件下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蝦頭、蝦殼蛋白酶解液中抗氧化肽的分離純化

1.3.2.1 超濾處理

取酶解物溶解后，用截留分子質(zhì)量分別為3 kDa和10 kDa的超濾管，將酶解液分成小于3 kDa、3～10 kDa、大于10 kDa 3 個(gè)部分，濃縮凍干后配制成0.1、0.2 mg/mL溶液。測(cè)試各組分的DPPH自由基清除率、還原力和ORAC，選擇抗氧化活性最強(qiáng)的組分進(jìn)行下一步的分離。

1.3.2.2 凝膠過濾色譜分離

將處理好的Sephadex G-50裝成18 mmh350 mm的層析柱，將超濾后活性最強(qiáng)的組分用去離子水溶解為50 mg/mL，上凝膠過濾色譜柱。凝膠過濾色譜柱先用去離子水平衡，然后用去離子水以1 mL/min的流速洗脫，每3 mL收集為1 管，在波長220 nm處檢測(cè)各管溶液的吸光度。收集各洗脫峰，濃縮及冷凍干燥后配制為0.1、0.2 mg/mL溶液，測(cè)試其DPPH自由基清除率、還原力、ORAC，篩選抗氧化活性最強(qiáng)的組分進(jìn)行下一步的分離純化。

1.3.2.3 制備液相色譜分離

將凝膠過濾色譜分離獲得的抗氧化活性最強(qiáng)的組分收集濃縮，過0.45 μm濾膜后上制備液相色譜。制備液相色譜條件為：流動(dòng)相A：0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）；流動(dòng)相B：乙腈＋0.1% TFA；梯度洗脫：0.0～5.0 min，5%流動(dòng)相B；5～45 min，5%～45%流動(dòng)相B；45～50 min，45%～95%流動(dòng)相B；50～53 min，95%～5%流動(dòng)相B；進(jìn)樣量4 mL；流速10 mL/min；檢測(cè)波長220 nm。收集各洗脫峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮及冷凍干燥后配制成0.1 mg/mL溶液，檢測(cè)其DPPH自由基清除率、還原力、ORAC，篩選抗氧化活性最強(qiáng)的組分。

1.3.3 抗氧化肽的純度檢測(cè)

將制備液相色譜分離獲得的活性最強(qiáng)的組分濃縮，過0.45 μm濾膜后，用分析型高效液相色譜檢測(cè)其純度。檢測(cè)條件為：Spursil C18色譜柱（250 mmh4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.1% TFA；流動(dòng)相B：乙腈＋0.1% TFA；洗脫條件：5%～45%流動(dòng)相B，40 min；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：220 nm。

1.3.4 抗氧化活性檢測(cè)

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照Najafian等[19]的方法并加以改進(jìn)。取2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液（溶于體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液）和2 mL待測(cè)液，振蕩混勻，室溫避光放置30 min后在517 nm波長處測(cè)吸光度At，同時(shí)，測(cè)定樣品溶液與蒸餾水混合的吸光度Ar，測(cè)定DPPH溶液的吸光度A0。設(shè)3 個(gè)平行，按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.4.2 還原力的測(cè)定

參照Wu Huichun等[20]的方法測(cè)定樣品的還原力。取樣品溶液2 mL，加入到2 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）和2 mL 1 g/L鐵氰化鉀溶液的混合液中?；旌衔镉?0 ℃保溫20 min后，加入2 mL 10 g/L三氯乙酸。取2 mL反應(yīng)混合物與2 mL蒸餾水以及0.4 mL 0.1 g/L氯化鐵溶液反應(yīng)10 min，測(cè)定其在700 nm波長處的吸光度。吸光度越大表明樣品的還原力越強(qiáng)。以蒸餾水代替待測(cè)液，其他條件相同，所得溶液作空白調(diào)零。

1.3.4.3 ORAC的測(cè)定

參照戴卉卿等[21]的方法，結(jié)果以Trolox的濃度表示，即將樣品熒光衰退曲線下的保護(hù)面積代入Trolox的線性方程中進(jìn)行計(jì)算，得出樣品的ORAC。

1.3.5 秀麗隱桿線蟲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抗氧化活性

1.3.5.1 給藥途徑

配制1 mg/mL抗氧化肽溶液和VC溶液，過濾除菌后，與大腸桿菌OP50菌液以質(zhì)量比5∶95混合均勻。吸取100 μL于線蟲生長培養(yǎng)基平板上喂養(yǎng)線蟲。此條件下，藥物通過線蟲攝食而進(jìn)入到線蟲體內(nèi)。

1.3.5.2 線蟲的同期化

用1 mL M9緩沖液將培養(yǎng)3 d左右的年輕成蟲洗至2 mL無菌EP管中，加入1 mL裂解液裂解線蟲，振蕩后3 000 r/min離心1 min，除去上清液。無菌操作下向EP管中加入1 mL M9緩沖液，振蕩后離心，重復(fù)2 次。洗滌兩次后的蟲卵以M9緩沖液懸浮，混勻后加入到線蟲生長培養(yǎng)基上，約48 h后蟲卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，完成同期化操作。

1.3.5.3 線蟲壽命的測(cè)定

線蟲分為空白組（喂食與實(shí)驗(yàn)組相同體積的蒸餾水）和實(shí)驗(yàn)組。挑取同期化的L4期線蟲于各組線蟲生長培養(yǎng)基中，每個(gè)板中約30 條，每組3 個(gè)平板。從轉(zhuǎn)移時(shí)刻開始計(jì)算線蟲存活時(shí)間，轉(zhuǎn)移當(dāng)天記為壽命實(shí)驗(yàn)第0天，每天將它們轉(zhuǎn)移到新的線蟲生長培養(yǎng)基中，到生殖后期（通常為第4天）后每2 d將線蟲轉(zhuǎn)移到新的線蟲生長培養(yǎng)基中以保證藥物的質(zhì)量濃度。隔天探視線蟲，記錄線蟲生存、死亡數(shù)量及剔除出實(shí)驗(yàn)的數(shù)量[22]。

1.3.5.4 產(chǎn)卵量的測(cè)定

線蟲分為空白組（喂食與實(shí)驗(yàn)組相同體積的蒸餾水）和實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)線蟲生長培養(yǎng)基中放置2 條線蟲，每組5 個(gè)線蟲生長培養(yǎng)基平板。每隔24 h將線蟲轉(zhuǎn)移至新的線蟲生長培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移4～5 次后，線蟲基本上已經(jīng)不再產(chǎn)卵。將轉(zhuǎn)移的線蟲繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20 ℃孵育24 h，對(duì)線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算所有轉(zhuǎn)移線蟲生長培養(yǎng)基上的產(chǎn)卵量并除以2，即可得到每條線蟲的產(chǎn)卵量[23]。

1.3.5.5 移動(dòng)力的測(cè)定

在壽命實(shí)驗(yàn)的第4、8天和第12天觀察并記錄線蟲的運(yùn)動(dòng)情況。記錄標(biāo)準(zhǔn)：A型：線蟲自發(fā)運(yùn)動(dòng)，不需要觸碰刺激；B型：線蟲必須受到觸碰刺激才運(yùn)動(dòng)；C型：線蟲受到觸碰刺激后只擺動(dòng)頭或尾[24]。

1.3.5.6 線蟲頭部擺動(dòng)次數(shù)的測(cè)定

將L4期的線蟲轉(zhuǎn)移到抗氧化肽組（添加抗氧化肽）、VC組（添加VC）和空白對(duì)照組（添加蒸餾水）3 種線蟲生長培養(yǎng)基中，在第2天和第6天時(shí)觀察線蟲在30 s內(nèi)的頭部擺動(dòng)次數(shù)，以此評(píng)價(jià)線蟲的運(yùn)動(dòng)能力[25]。

1.3.5.7 熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

取同期化的L4期線蟲，轉(zhuǎn)移到抗氧化肽組（添加抗氧化肽）、VC組（添加VC）和空白對(duì)照組（添加蒸餾水）3 種線蟲生長培養(yǎng)基上，每組3 個(gè)線蟲生長培養(yǎng)基平板，每個(gè)線蟲生長培養(yǎng)基放置50 條線蟲，20 ℃培養(yǎng)48 h。隨后將線蟲轉(zhuǎn)移至37 ℃烘箱中處理1 h，然后置于20 ℃培養(yǎng)箱中恢復(fù)10 min，記錄線蟲的存活數(shù)量，按式（2）計(jì)算線蟲存活率[26]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0軟件中的Duncan multiple進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05為差異顯著。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化肽的分離純化

2.1.1 超濾分離結(jié)果

超濾是一種膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，小分子的溶質(zhì)和溶劑能穿過一定孔徑的特制薄膜，而大分子的溶質(zhì)不能透過，留在了膜的另一邊，從而實(shí)現(xiàn)了大分子和小分子物質(zhì)的分離[27]。將南美白對(duì)蝦蝦頭、蝦殼的風(fēng)味蛋白酶酶解液進(jìn)行超濾處理，得到了3 個(gè)組分：分子質(zhì)量小于3 kDa組分、3～10 kDa組分、大于10 kDa組分。如圖1所示，超濾后各組分的DPPH自由基清除率、還原力和ORAC均隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加，但以分子質(zhì)量為3～10 kDa組分的抗氧化活性最高。在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL和0.1 mg/mL時(shí)，3～10 kDa組分的DPPH自由基清除率分別為7.70%和2.67%，ORAC分別為82.82 μmol/L和57.80 μmol/L，均顯著高于其他兩個(gè)組分（P＜0.05）。分子質(zhì)量為3～10 kDa組分在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)還原力達(dá)0.033，顯著高于其他兩個(gè)組分。

圖1 酶解液超濾后各組分的DPPH自由基清除率（A）、還原力（B）和ORAC（C）Fig.1 DPPH radical scavenging capacity (A), reducing power (B) and ORAC (C) of each ultraf i ltration fraction

2.1.2 凝膠過濾色譜分離結(jié)果

凝膠過濾色譜根據(jù)被分離組分的分子質(zhì)量不同將其分開，混合肽溶液在分離時(shí)，小分子多肽能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙中，洗脫速度慢，而大分子多肽被排阻在凝膠顆粒外部，所以比小分子多肽更早地被洗脫下來。

圖2 酶解液分子質(zhì)量3～10 kDa組分凝膠過濾色譜圖Fig.2 Gel fi ltration chromatography of peptides with molecular mass of 3–10 kDa

由圖2可知，3～10 kDa組分經(jīng)Sephadex G-50分離后被分成了5 個(gè)組分。

圖3 酶解液凝膠過濾層析后各組分的DPPH自由基清除率（A）、還原力（B）和ORAC（C）Fig.3 DPPH radical scavenging capacity (A), reducing power (B) and ORAC (C) of each subfraction from gel fi ltration chromatography

由圖3可知，凝膠過濾色譜所獲得的5 個(gè)組分的DPPH自由基清除率、還原力和ORAC均隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。其中峰2的DPPH自由基清除率、還原力、ORAC在0.2 mg/mL和0.1 mg/mL時(shí)都為最大，且均顯著高于其他組分（P＜0.05），分別為8.06%和6.70%、0.089和0.030、181.94 μmol/L和99.23 μmol/L。表明抗氧化組分具有清除DPPH自由基、通過轉(zhuǎn)移電子達(dá)到還原一些組分的能力和提供氫原子捕獲自由基的能力。

2.1.3 制備液相色譜分離結(jié)果

圖4 凝膠過濾酶解液峰2的制備液相色譜圖Fig.4 Preparative liquid chromatogram of subfraction 2

由圖4可知，凝膠過濾色譜得到的第2個(gè)峰經(jīng)過制備液相色譜后被分成了9 個(gè)組分。

圖5 酶解液制備液相色譜分離后各組分的DPPH自由基清除率（A）、還原力（B）和ORAC（C）Fig.5 DPPH radical scavenging capacity (A), reducing power (B) and ORAC (C) of each component from preparative liquid chromatography

由圖5可知，在酶解液質(zhì)量濃度0.1 mg/mL時(shí)，峰6的DPPH自由基清除率最強(qiáng)，為10.05%；峰3的DPPH自由基清除率也相對(duì)較高，為8.66%，其與峰6沒有顯著差異（P＞0.05），而其還原力與ORAC最高，分別為0.090 μmol/L和146.91 μmol/L，且顯著高于其他組（P＜0.05）。以VC為陽性對(duì)照，0.1 mg/mL VC溶液的ORAC為76.82 μmol/L（未在圖中顯示），本研究所得抗氧化肽（峰3）的ORAC高于VC。由于ORAC法是目前普遍被接受的檢測(cè)抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法，具有接近機(jī)體生理?xiàng)l件、操作簡單、準(zhǔn)確性和認(rèn)可度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于食品、藥品、保健品等領(lǐng)域[28]。因此，選取峰3所得抗氧化肽進(jìn)行后續(xù)的體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)。

2.2 抗氧化肽純度檢測(cè)結(jié)果

圖6 制備液相色譜分離酶解液峰3高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatographic separation of peak 3 from preparative liquid chromatography

如圖6所示，該組分存在一個(gè)大峰和一些很小的峰，根據(jù)峰面積歸一法計(jì)算出該大峰的面積約占70%。說明該組分中含有一個(gè)純度較高的抗氧化肽段，且所獲得的抗氧化肽的純度明顯高于其他文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果，如Shazly等[11]分離的抗氧化肽純度為54.84%，范建鳳等[12]從蟹下腳料獲得抗氧化肽純度最高為41.44%。

2.3 抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 抗氧化肽對(duì)線蟲壽命的影響

圖7 各處理組對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.7 Effect of the purif i ed antioxidant peptides on the life span of C. elegans

如圖7所示，空白對(duì)照組線蟲的平均壽命為17.82 d，VC組線蟲的壽命為19.03 d，而喂食抗氧化肽的線蟲的平均壽命達(dá)到了19.62 d。VC組和抗氧化肽組線蟲的壽命顯著長于空白對(duì)照組（P＜0.05），但兩者間無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，抗氧化肽處理可以延長線蟲的平均壽命，說明抗氧化肽可通過清除線蟲體內(nèi)的自由基，增強(qiáng)線蟲的抗氧化應(yīng)激能力，從而產(chǎn)生抗氧化保護(hù)作用。

2.3.2 抗氧化肽對(duì)線蟲生殖能力的影響

圖8 不同處理組秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵量Fig.8 Fecundity of C. elegans in different treatment groups

由圖8可知，各組處理中，線蟲的生育高峰均為第1天和第2天，產(chǎn)卵量遠(yuǎn)高于其他時(shí)間。由不同處理組線蟲的總產(chǎn)卵量結(jié)果可得，空白對(duì)照組、VC組、抗氧化肽組每條線蟲產(chǎn)卵量分別為142.40、166.30 個(gè)和175.50 個(gè)。VC組和抗氧化肽組線蟲的產(chǎn)卵量均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。說明本研究所得抗氧化肽可以提高線蟲的生殖能力。

2.3.3 抗氧化肽對(duì)線蟲移動(dòng)力的影響

圖9 不同時(shí)期秀麗隱桿線蟲移動(dòng)力Fig.9 C. elegans movement force after treatment with antioxidants for different periods

如圖9所示，自發(fā)運(yùn)動(dòng)的線蟲所占比例隨著壽命的延長呈逐漸下降的趨勢(shì)，但是空白對(duì)照組、VC組和抗氧化肽組三者差異不大。線蟲受到觸碰才運(yùn)動(dòng)的比例隨著時(shí)間的延長而逐漸增加，3 組差異不大。線蟲受到觸碰后只擺動(dòng)頭部或尾部的比例在第4天時(shí)各組均為0%，而到了第8、12天后比例逐漸增加。說明隨著線蟲衰老程度的增加，線蟲的移動(dòng)力呈逐步下降的趨勢(shì)。但是實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的移動(dòng)力差異不大。

2.3.4 抗氧化肽對(duì)線蟲頭部擺動(dòng)次數(shù)的影響

圖10 不同處理組秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)次數(shù)Fig.10 Head swinging frequency of C. elegans in different treatment groups

如圖10所示，第6天時(shí)線蟲的頭部擺動(dòng)次數(shù)均低于第2天，說明在線蟲的衰老過程中，其運(yùn)動(dòng)行為能力逐漸下降。與空白對(duì)照組相比，VC組和抗氧化肽組線蟲的頭部擺動(dòng)次數(shù)均沒有明顯提高，三者沒有顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，本研究所得抗氧化肽對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)行為能力中的頭部擺動(dòng)次數(shù)沒有顯著影響。說明抗氧化肽在提高線蟲壽命和生殖能力的前提下，沒有對(duì)線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力造成不利影響。

2.3.5 抗氧化肽對(duì)熱應(yīng)激條件下線蟲存活率的影響

圖11 熱應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲的存活率Fig.11 Survival rates of C. elegans under heat stress

如圖11所示，在37 ℃烘箱中處理1 h后，抗氧化肽組、VC組、空白對(duì)照組的線蟲存活率分別為59.33%、46.67%和42.00%?？寡趸奶幚砜娠@著提高線蟲的存活率（P＜0.05），其比空白對(duì)照組提高了41.26%，比VC組提高了27.13%。Zhang Longze等[29]在研究茶多酚對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在35 ℃熱應(yīng)激的條件下，預(yù)先用茶多酚處理48 h的線蟲的存活率顯著提高。研究結(jié)果表明在熱應(yīng)激條件下，抗氧化肽處理可以顯著提高線蟲的存活率。

3 討 論

以DPPH自由基清除能力、還原力和ORAC為指標(biāo)，對(duì)風(fēng)味蛋白酶最佳水解條件下得到的酶解液進(jìn)行分離純化。經(jīng)超濾、凝膠過濾色譜和液相制備色譜分離后，獲得了一個(gè)純度和抗氧化活性均較高的肽段。

采用秀麗隱桿線蟲模型，通過對(duì)線蟲壽命、產(chǎn)卵量、運(yùn)動(dòng)能力、移動(dòng)力和熱應(yīng)激條件下的存活率等指標(biāo)的測(cè)定，評(píng)價(jià)抗氧化肽通過清除線蟲體內(nèi)的自由基從而對(duì)其產(chǎn)生的抗氧化保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是線蟲衰老的關(guān)鍵因素，線蟲的抗氧化應(yīng)激能力和壽命有較好的相關(guān)性[30]。本研究中，抗氧化肽處理可以延長線蟲的平均壽命，說明抗氧化肽通過清除線蟲體內(nèi)的自由基，增強(qiáng)線蟲的抗氧化應(yīng)激能力，從而產(chǎn)生抗氧化保護(hù)作用。

產(chǎn)卵量主要反映了線蟲的生殖能力，因此測(cè)定線蟲的產(chǎn)卵量能研究所得抗氧化肽對(duì)其生殖能力方面的影響。本研究結(jié)果說明抗氧化肽對(duì)線蟲生殖能力具有保護(hù)作用。

頭部擺動(dòng)次數(shù)反映了線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力，移動(dòng)力同樣也反映了線蟲的運(yùn)動(dòng)情況，通過對(duì)線蟲頭部擺動(dòng)次數(shù)和移動(dòng)力的檢測(cè)推測(cè)抗氧化肽在提高線蟲其他生理功能的同時(shí)是否會(huì)損害其運(yùn)動(dòng)行為能力。本研究結(jié)果表明，抗氧化肽組、VC組和空白對(duì)照組的差異不大，說明抗氧化肽在延長線蟲壽命和提高生殖能力的前提下，沒有對(duì)線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力造成不利影響。

機(jī)體在壓力環(huán)境下的抵抗能力被稱為壓力應(yīng)激能力，壓力狀態(tài)下線蟲的應(yīng)激能力與其壽命之間存在著很強(qiáng)的相關(guān)性。研究表明，許多長壽型突變體線蟲都是伴隨著壓力應(yīng)激能力的提高而壽命延長的[31]。熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)考察的是線蟲對(duì)急性氧化損傷的抵抗能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗氧化肽能夠顯著提高線蟲在壓力環(huán)境下的存活率。在熱應(yīng)激條件下，抗氧化肽處理同樣可以顯著提高線蟲的存活率，得到該結(jié)果的原因可能是抗氧化肽的自由基清除作用以及提高應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)作用等。提高線蟲在壓力條件下的應(yīng)激能力可能是抗氧化肽延長線蟲壽命的作用機(jī)理之一。

綜上所述，喂食抗氧化肽的秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵量、壽命和熱應(yīng)激條件下的存活率均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），且與VC組沒有顯著差異（P＞0.05）。其移動(dòng)力、頭部擺動(dòng)次數(shù)與空白組、陽性對(duì)照組均沒有顯著差異（P＞0.05）。本研究所獲得的抗氧化肽對(duì)秀麗隱桿線蟲具有和VC相當(dāng)?shù)目寡趸Ｗo(hù)作用。