錢敏艷 王曉芳

摘要 敘述了普通高中應如何開展植物組培實驗的建設和課程開發(fā)以及組織培養(yǎng)過程中的一些成功的經(jīng)驗和不足之處的反思。

關鍵詞 植物組織培養(yǎng) 實驗室建設 課程實踐

中圖分類號 G633.91

文獻標志碼 B

1新課標對植物組織培養(yǎng)技術的要求

《普通高中生物學課程標準（2017年版）》（以下簡稱新課標）的基本理念強調(diào)以核心素養(yǎng)為宗旨，教學過程重實踐，在教學過程中要讓學生主動參與學習過程，多動手動腦，加深對生物學概念的理解，進而提升應用知識的能力。在新的高中生物學課程結(jié)構中，選擇性必修模塊《生物技術與工程》以及選修模塊“學業(yè)發(fā)展基礎”都要求學習植物組織培養(yǎng)技術。選擇性必修模塊《生物技術與工程》的內(nèi)容標準中要求學生闡明植物組織培養(yǎng)是在一定條件下，將離體植物器官、組織和細胞在適宜的培養(yǎng)條件下誘導形成愈傷組織，并重新分化，最終形成完整植株的過程。新課標認為植物組織培養(yǎng)室不需要昂貴的儀器設備和藥品，投資少，可以在短時間內(nèi)不受自然條件限制培育出大量具有優(yōu)良性狀的幼苗。在新課標下，建設一個適合學生使用的植物組織培養(yǎng)實驗室將成為必然。

2植物組織培養(yǎng)實驗室的改建與設備購置

作為一般的普通高中，建設一個與大學實驗室條件相當?shù)闹参锝M織培養(yǎng)室需要30萬左右的資金，實現(xiàn)的可能性較小。我校的自然科學實驗中心雖為江蘇省課程基地項目，但由于是數(shù)理化生共建的項目，所以經(jīng)費也并不是太充裕。為了既能適應新課程標準對教學的要求，又能在力所能及的范圍內(nèi)完成實驗室改造，我校對植物組織培養(yǎng)實驗室進行了如下的建設，總體的費用約10萬。

2.1實驗室的改建

通過對高校和一些中學生物課程基地校植物組織培養(yǎng)實驗室的參觀學習，以及與生物技術公司的交流，選擇了一間光線良好、長12m、寬8m的普通實驗室進行改造。為了滿足植物組織培養(yǎng)室的各種條件，把實驗室分成了更衣室、無菌室、培養(yǎng)室、煉苗室、教學區(qū)等區(qū)域。

2.2實驗設備的購置

植物組織培養(yǎng)過程中對無菌的要求很高，我校在改建中為了節(jié)省成本，沒有建風淋室。為了保證實驗效果，購置了紫外滅菌燈放在無菌室，用于實驗前的環(huán)境消毒。除此之外，高壓滅菌鍋、超凈工作臺、接種器具殺菌器、組培接種服等都是滿足無菌條件的重要保障。決定組織培養(yǎng)能夠成功的另一重要因素是培養(yǎng)基，教師可以根據(jù)教材上的培養(yǎng)基配方自己配制，也可以直接從生物技術公司購買MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基中的各種元素比例要求嚴格，如果直接拿自來水來配制也會導致實驗的失敗，因此需要用純水器來制備超純水。接種后的無菌苗必須置于潔凈度高、光照充足、溫濕度適宜的環(huán)境。智能光照培養(yǎng)箱能夠滿足以上要求，它與光照培養(yǎng)架的不同在于可以提供恒定的溫度，具有溫度、光照度程序設定功能，能夠滿足實驗的要求。具體設備購置情況見表1，如果實驗室建設經(jīng)費有限，其中的移液器、電熱鼓風干燥箱可以暫不購置。

3課程開發(fā)

3.1課程說明

植物組織培養(yǎng)是基于植物細胞具有全能性這一理論，近幾十年發(fā)展起來的一項植物體無性繁殖的新技術。通過本課程的學習，學生將掌握植物組織培養(yǎng)基制備、外植體接種、繼代培養(yǎng)、移栽等相關知識和技能，初步具備植物組織培養(yǎng)的職業(yè)素養(yǎng)，為今后大學專業(yè)選擇提供指導，奠定基礎。本課程的成績評定將由以下三部分組成：

1學生的課堂表現(xiàn)占20%，包括出勤率、課堂參與程度;2實驗過程的規(guī)范性和實驗成功率占50%;3學習撰寫相應的小論文占30%。

3.2課程目標

1通過本課程的學習，能說出植物組織培養(yǎng)實驗室常用的儀器、設備及用具的使用方法;明確植物組織培養(yǎng)工作的程序，說出無菌操作的原則;掌握培養(yǎng)基配制與滅菌、接種、培養(yǎng)及組培苗馴化移栽的方法;能分析實驗操作過程中成敗的原因。

2通過本課程的學習，能正確使用并維護植物組織培養(yǎng)實驗室的儀器與設備;熟悉植物組織培養(yǎng)技術的程序，遵循無菌操作原則進行培養(yǎng)基的配制與滅菌、接種、培養(yǎng)及組培苗馴化移栽;能夠按照培養(yǎng)對象正確選擇有效的培養(yǎng)基，正確調(diào)控培養(yǎng)條件;成功培養(yǎng)一些植物器官。

3.3課程內(nèi)容設計

從植物組織培養(yǎng)課程選題，將植物組織培養(yǎng)技術所需要的知識和技能進行整合和簡化，使之適合我?，F(xiàn)有的實驗條件和高中學生能接受的程度，形成植物組織培養(yǎng)課程教學的兩個課程單元，共整合為8個主題：單元一“植物組織培養(yǎng)基本操作技術”;單元二“植物組織培養(yǎng)實際應用技術”。這些主題覆蓋了植物組織培養(yǎng)實驗室內(nèi)操作的全部過程，具體教學內(nèi)容與學時分配如下。

單元一“植物組織培養(yǎng)基本操作技術”包括：

1植物組織培養(yǎng)的基本認識（共2個課時）——植物組織培養(yǎng)的概念、植物細胞的全能性、脫分化與再分化;

2植物組織培養(yǎng)實驗及設備使用（共2個課時）——植物組織培養(yǎng)實驗室的設置、常用設備儀器及使用、常用器皿的洗滌;

3培養(yǎng)基配制（共2個課時）——培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求和環(huán)境要求、培養(yǎng)基的基本類型、母液的配制方法與培養(yǎng)基的配制;

4外植體接種（共2個課時）——如何選擇外植體、外植體的表面滅菌、常用的表面滅菌劑、外植體接種。

單元二“植物組織培養(yǎng)實際應用技術”包括：

1矮牽牛莖尖組織培養(yǎng)（共2個課時）;

2煙草不定芽誘導及完整植株形成（共2個課時）;

3菊花莖尖與花瓣組織培養(yǎng)（共2個課時）;

4石斛植物離體快繁（共1個課時）。

學生實踐參觀，整理實驗報告，整理小論文（2個課時）。另有1個課時作為機動安排。

3.4實驗操作評價

在上述8個主題的教學活動中，每個學習小組必須完成四個方面的操作內(nèi)容作為實驗評價的依據(jù)，包括：

（1）每組學生每人能獨立完成組培室的無菌操作，減少組培苗的雜菌感染率;

（2）每組分別配制大量元素母液1000mL、微量元素母液1000mL、鐵鹽母液1000mL、有機物母液500mL;

（3）選擇1或2種外植體進行預處理，并完成外植體表面滅菌的任務;

（4）每組完成根、莖、葉外植體各20瓶培養(yǎng)基接種任務。

4植物組織培養(yǎng)實踐——以矮牽牛為例

4.1培養(yǎng)基的配制

取出母液和植物生長調(diào)節(jié)劑溶液并按順序放好。將潔凈的各種器皿，如量筒、燒杯、移液管、移液槍和玻璃棒等放在合適位置。取一只1L燒杯，放入約500mL蒸餾水，依次加入大量元素母液1（100mL）、微量元素母液2（10mL）、鐵鹽母液3（10mL）和有機物質(zhì)母液4（5mL），并不斷攪拌。加入瓊脂（通常5.0～7.0g/L），加熱使其完全溶解。加入30g蔗糖，待蔗糖溶解后加蒸餾水定容至1L。調(diào)整pH至5.6～5.8，用預先配好的氫氧化鈉或鹽酸進行調(diào)節(jié)。

4.2培養(yǎng)基的分裝、滅菌

將1000mL培養(yǎng)基分裝進滅菌后的20個小型培養(yǎng)瓶，每瓶約50mL培養(yǎng)基。將分裝過后的培養(yǎng)瓶再次用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20min，滅菌后待高壓鍋壓力下降到0Pa時取出，待培養(yǎng)基溫度降至40～50°C時，在超凈工作臺上加入過濾除菌的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，50mL培養(yǎng)基加0.1mL的NAA和0.1mL的6-BA，用移液槍取樣，充分混合后靜置凝固后再用。實驗過程中需要用的無菌水、接種盤等可同時高壓滅菌。

4.3對無菌接種間滅菌

每次接種操作前提前3h打開接種間的紫外燈消毒，把整個實驗所需用到的實驗材料和器材放到超凈工作臺內(nèi)用紫外燈再滅菌數(shù)小時。超凈工作臺中放有接種器械滅菌器，實驗過程中需要用到的鑷子、剪刀等用具插入接種器具滅菌器（300°C）中滅菌。

4.4實驗操作者的消毒

操作者進入接種室前，要在準備室內(nèi)用溫水和肥皂清洗雙手并擦干，指甲縫內(nèi)要用酒精特別消毒，不允許留長指甲。進入接種間前換上消毒好的接種服，在超凈工作臺里進行接種操作之前，用體積分數(shù)為70%的酒精擦拭雙手。

4.5外植體的獲取和接種

從已有的組培苗中剪取外植體，可以盡可能避免雜菌污染。植株不同部位的組織、器官中生理狀態(tài)有很大不同，對培養(yǎng)基的反應也不同，因此選擇合適的外植體對于實驗能否成功很重要。外植體可分為帶芽的外植體和分化組織構成的外植體，如帶有側(cè)芽的莖尖就是帶芽外植體。對于大多數(shù)植物來說，莖尖無疑是較好的取材部位，因為其形態(tài)已基本形成，生長速度快，莖段側(cè)芽或頂芽容易萌發(fā)。打開已有組培苗的培養(yǎng)瓶，取出矮牽牛小苗于接種盤中，用消毒并冷卻的剪刀和鑷子剪取矮牽牛莖尖的莖段，打開裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，插入莖段并迅速蓋上瓶蓋，插入時注意莖段的方向，不要倒插。此過程中，如果是教師操作，可在酒精燈周圍進行實驗操作，接種完成后培養(yǎng)瓶口和瓶蓋在火焰上過幾圈可以更好地防止雜菌污染。如果是學生操作，可以不使用酒精燈，以免操作臺內(nèi)物品太多造成危險。使用過的器械可用無菌水沖洗后重新插入高溫滅菌器滅菌，進行下一次操作。

4.6接種后外植體的培養(yǎng)、觀察

待同一批接種完畢后，取出培養(yǎng)瓶并貼上標簽，標注接種材料和日期，然后放入智能光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。溫度設置為25°C，光照、黑暗各12h交替進行。實驗記錄顯示3月7日接種15瓶矮牽牛，一星期后就有部分外植體長出了新芽，有兩瓶發(fā)生了雜菌污染，其余長勢良好.兩周后，取出培養(yǎng)瓶移入光照培養(yǎng)架。4月7日觀察時發(fā)現(xiàn)有一瓶矮牽牛已開出紫色小花。

5實驗過程中的經(jīng)驗與反思

5.1成功經(jīng)驗總結(jié)

5.1.1取材的方法

按照植物的生長規(guī)律，在春夏季節(jié)取材，材料幼嫩，細胞分裂旺盛，室外氣溫適宜，組織培養(yǎng)容易取得成功;反之，秋冬季節(jié)進行實驗，培養(yǎng)成功概率相對較低。

5.1.2培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基配制的過程中，水浴加熱時間太長，影響學生實驗過程，所以可用700W微波爐高火加熱7min，效果與水浴加熱相同。高壓滅菌時，玻璃培養(yǎng)瓶可滅菌25min，塑料培養(yǎng)瓶滅菌20min，滅菌時間過長會導致瓊脂變質(zhì)、不易凝固。滅菌結(jié)束后應立即把培養(yǎng)基取出放入超凈工作臺冷卻，因為如果在高壓滅菌鍋中冷卻，由于余溫仍很高，培養(yǎng)基會變黃。

5.1.3超凈工作臺的使用

超凈工作臺在接種前關掉紫外燈，工作臺拉門打開少許，等待2min，待臭氧氣體排出后再進行操作，同時打開照明燈，風扇速度調(diào)至慢速。實驗操作者雙手伸入超凈工作臺，盡可能不要有著有衣物部分進入，雙手及手腕處多用酒精棉球擦拭幾遍。超凈臺中接種器械滅菌器內(nèi)鑷子溫度很高，使用時需先取出冷卻或沒入無菌水冷卻，避免燙傷外植體。

5.2困難與反思

我校改造的無菌室可放置3-4臺超凈工作臺，可容納的學生人數(shù)少。每次教學活動時，學生只能分批進行實驗。學生操作培養(yǎng)的試管苗被污染率要明顯高于教師培養(yǎng)的試管苗，說明學生進行操作時消毒跟滅菌過程中還不夠徹底。目前成功接種了大量的矮牽牛、菊花、煙草苗，均是以莖尖為實驗材料直接培養(yǎng)出了根和芽，而沒見到愈傷組織。如需觀察愈傷組織，則在MS培養(yǎng)基的基礎上還需添加等量的0.2mg/mL的細胞分裂素和生長素，并進行暗培養(yǎng)，這還需進行進一步的探究。