周浩，向立剛，陳乾麗，汪漢成，余知和

1 長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；

2 貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081

漂浮育苗是目前我國煙草生產(chǎn)采用的主要育苗方式，煙苗生產(chǎn)效率高，長勢整齊，易于管理[1-3]。近年來，隨著育苗大棚的連續(xù)使用及育苗漂盤的重復使用，局部煙區(qū)育苗工廠發(fā)生多種苗期病害，如苗期灰霉病[4]、立枯病[5]、根腐病[6]等。此外，苗期長期低溫寡照，溫室大棚內濕度高，育苗基質易滋生多種微生物，其中，基質上出現(xiàn)苔蘚[7]和腐生真菌較為常見，它們嚴重影響煙苗的生長，導致部分煙苗枯死。有關煙草育苗基質上出現(xiàn)腐生真菌尚未見報道。為此，本文對煙苗漂盤育苗基質上出現(xiàn)的典型腐生真菌進行分離，并結合形態(tài)學特征和rDNA-ITS序列分析對其進行了鑒定，同時對其在Biolog FF板上碳源代謝特征進行了分析。研究結果對了解煙草育苗基質腐生真菌的種類和指導煙草苗期病害的防治提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年3—4 月在貴州省遵義市正安縣斑竹煙葉站育苗大棚內，采集典型的帶有腐生真菌的煙苗苗盤基質置于無菌采樣袋內，4℃保存于貴州省煙草科學研究院微生物實驗室，待用。

1.2 腐生菌分離

采用組織分離法[8]對基質上典型腐生真菌進行分離，樣品于PDA培養(yǎng)基、28℃黑暗下培養(yǎng)3 d，用接種針挑取邊緣的菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，重復接種三代。將純化的培養(yǎng)物依次編號，并于4℃下保存。

1.3 腐生菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定將純化的菌株接種到PDA培養(yǎng)基28℃黑暗培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)；7 d后從平板上挑取少量菌絲進行鏡檢，觀察其菌絲和分生孢子的形態(tài)特征。

1.3.2 分子生物學鑒定

將保存的菌株接種至PDA 培養(yǎng)基上，生長7 d，從培養(yǎng)皿中刮取菌絲，放入裝有50 μL裂解液（大連寶生物工程有限公司）的離心管中，80℃水浴裂解15 min，取裂解后液體3 μL，采用引物 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對 ITS內轉錄間隔區(qū)進行 PCR 擴增[9-11]。PCR擴增體系：Premix Taq（EX Taq version 2.0 plus dye）（大連寶生物工程有限公司） 25 μL，DNA模板 3 μL，引物（ 20μmol/L）各1 μL，去離子水補足至50 μL。PCR反應條件：94℃預變性10 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸105 s，進行30個循環(huán)，72℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后送至上海捷瑞生物工程有限公司進行測序。測序結果在GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中進行BLAST對比分析。在NCBI 數(shù)據(jù)庫中登錄該真菌的基因序列信息。用分子進化遺傳分析軟件MEGA 7.0中Neighbor-Jioning方法構建ITS序列系統(tǒng)進化樹。

1.4 致病性測定

致病力測定選用烤煙主栽品種云煙87，煙苗在貴州省煙草科學研究院溫室內培育至兩片子葉。將分離的3株腐生真菌在PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d，用直徑8 mm的打孔器從菌落邊緣打取菌碟，將菌碟1）分別接種于刺過傷口的煙苗葉片上，2）分別接種于無傷口的煙苗基質上，以未接菌煙苗處理作為對照。接菌后，將煙苗置于相對濕度70%、23℃恒溫培養(yǎng)10 d，觀察煙苗發(fā)病情況。采集發(fā)生病害的煙苗樣品，采用組織分離法對病原菌進行分離，并參照1.3.2的方法對病原菌進行分子生物學鑒定。

1.5 碳源代謝特征分析

采用BIOLOG FF 96孔微孔板對分離所得真菌進行鑒定，并進行其碳源代謝特征分析，按照BIOLOG公司FF的操作指南進行碳代謝測試[12-14]。收集在PDA平板上培養(yǎng)7 d的腐生真菌的分生孢子，用分生孢子調整接種液的濁度為75% T，將菌懸液倒入V型加樣槽中，移液器將100 μL菌懸液依次加入微孔板所有孔中，28 ℃黑暗培養(yǎng)，96 h后檢測分離真菌對95種碳源物質的代謝情況。根據(jù)真菌利用95種碳源物質進行新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質發(fā)生反應而導致的顏色變化、以及微生物生長造成的濁度差異進行鑒定。獲得真菌的代謝“指紋圖譜”，通過智能軟件將獲得的圖譜與數(shù)據(jù)庫比對，獲得最大限度的匹配，得出鑒定結果。根據(jù)鑒定結果，以菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3為對象，根據(jù)其在Biolog FF微孔板上96 h后的代謝圖譜，分析腐生真菌對95種碳源的代謝特征。

2 結果與分析

2.1 腐生真菌分離

經(jīng)組織分離共得到3株菌株，依次編號為JZ-1、JZ-2和JZ-3，各菌株的菌落形態(tài)如圖1所示。腐生真菌菌株JZ-1、JZ-2及JZ-3在PDA 培養(yǎng)基上生長良好，2 d即可長滿培養(yǎng)皿。初生菌落均為白色，3 d后轉為黃綠色，5 d后菌株JZ-1、JZ-2變?yōu)榫G色，菌株JZ-3變?yōu)槟G色。

圖1 菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strains

2.2 腐生菌鑒定

菌株JZ-1和JZ-2的菌絲纖細無色，具分隔，多分枝。分生孢子梗叢束疏松，環(huán)狀排列，主分枝呈樹狀，其上有眾多次級分枝。分生孢子呈球形、倒卵圓形，大小為2.50～3.75 μm。菌株JZ-3分生孢子梗呈環(huán)狀排列，次級分枝單個或以2～3個為一組，分枝彎曲或波狀。分生孢子呈球形，直徑為2.5～4.8 μm。形態(tài)學鑒定結果表明，3株真菌均與木霉菌屬Trichoderma真菌形態(tài)類似。

引物ITS1F/ITS4從菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3基因組中均擴增出長度約為600 bp的DNA片段。利用Blast進行同源性比較比對，結果顯示菌株JZ-1（MG171155）和JZ-2（MG171156）與已報道的Trichoderma harzianum（KJ000320）同源性達100%，菌株JZ-3（MG171157）與已報道的Trichoderma asperellum同源性達100%（表1）。

表1 腐生真菌的分子生物學鑒定Tab.1 Molecular identification of saprophytic fungi

3個菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 腐生真菌JZ-1、JZ-2和JZ-3的ITS序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of saprophytic fungi JZ-1, JZ-2 and JZ-3

綜合形態(tài)學特征及ITS序列分析結果，菌株JZ-1和JZ-2被鑒定為哈茨木霉（Trichoderma harzianum），菌株JZ-3被鑒定為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

2.3 致病性測定

致病性測定結果如圖3所示。葉片創(chuàng)傷接菌10 d后，菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3均可使煙苗發(fā)?。▓D3 B中b、c、d）。發(fā)病部位初呈水漬狀，逐漸擴展，病斑褐色，葉片隨著接菌時間的延長而腐爛，最后煙苗腐爛至死?；|接菌10 d后，菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3均未能使煙苗發(fā)?。▓D3 D中b、c、d）。

圖3 腐生菌致病性測定Fig.3 Determination of the pathogenicity of saprophytic fungi

對菌株JZ-1、JZ-2和JZ-3創(chuàng)傷接菌的感病煙苗重新進行病原菌分離，得到菌株R-JZ-1、R-JZ-2和R-JZ-3。對其進行分子生物學鑒定，經(jīng)鑒定，R-JZ-1和R-JZ-2 ITS基因序列與已報道的Trichoderma harzianum同源性達100%，菌株R-JZ-3的與已報道的Trichoderma asperellum同源性達100%。它們的基因登錄號分別為MH598839、MH598840和MH598841。

2.4 碳源代謝特征分析

腐生真菌的碳源代謝特征如表2所示。哈茨木霉JZ-2能利用單糖、醇、多糖等59種碳源，有57種碳源能促進其產(chǎn)孢，其中，D-纖維二糖、糊精、赤蘚糖醇、D果糖等24種碳源能促進該菌株大量產(chǎn)孢。棘孢木霉JZ-3能利用單糖、醇、多糖能利用55種碳源，有53種碳源能促進其產(chǎn)孢，其中，N-乙?；??-D-葡萄糖胺、赤蘚糖醇、D果糖、乳果糖、麥芽糖、D-甘露醇、D-甘露醇、D-蜜二糖、α-甲基-D-半乳糖苷、D-山梨醇、D-塔格糖11種碳源能促進該菌株大量產(chǎn)孢。菌株JZ-2和JZ-3都能利用的碳源有44種，都無法利用的有27種。

3 討論

形態(tài)學特征分析是一種傳統(tǒng)的、基礎的微生物鑒定方法，通過顯微鏡觀察菌絲、孢子和分生孢子梗的形態(tài)來確定歸屬[15]。真菌ITS序列分析是目前最常用的分子鑒定方法之一，通過核苷酸序列的同源性比對來確定待測微生物的屬種。Biolog鑒定是基于微生物對碳源代謝的特征性圖譜來進行鑒定的。本文采用3種方法相結合的手段對煙草育苗基質中典型腐生真菌進行了分離與鑒定，并對其碳源代謝特征進行了系統(tǒng)分析。研究結果對了解育苗基質中腐生真菌的種類和指導煙草苗期病害的防治奠定了基礎。

表2 腐生真菌對Biolog FF 板碳源的利用及其產(chǎn)孢情況Tab.2 Carbon substrate utilization and sporulation of saprophytic fungi on Biolog FF microplate

續(xù)表2

漂浮育苗基質是煙草漂浮育苗的核心，除具有支持和固定植株外，更重要的是充當中轉站的作用，使來自營養(yǎng)液的養(yǎng)分和水分得以中轉至煙苗。目前國內外常用的基質主要是富含有機質的材料，如草炭或腐熟的植物殘體等再附加膨脹珍珠巖、蛭石等[2]。育苗基質出現(xiàn)菌落可能是基質純度和物料腐熟程度不合乎要求，抑或是環(huán)境中微生物利用其豐富的營養(yǎng)而生長。木霉適應環(huán)境能力強，廣泛存在于自然界土壤、空氣和腐爛植物殘體等多種基質中[16-18]。為此，本文較容易從煙草育苗基質中分離獲得木霉菌。據(jù)報道，木霉菌具有產(chǎn)生抗生素、細胞壁分解酵素和誘導植物抗性等特性，可用于生物防治、土壤改良、生物肥料等[19]。木霉菌可以適應一定范圍的生物脅迫和生理壓力[20-21]。作為生防菌，研究發(fā)現(xiàn)木霉菌具有比一般致病菌更強的競爭和生存能力，在抑制病原菌生長、尤其在土傳病害的防治中起著重要作用[22]，成為一種很有開發(fā)利用價值的生防菌。莊敬華等人的研究表明生防木霉菌（Trichoderma virideT23）對甜瓜安全，對動物和環(huán)境無較大影響[23]。相比而言，本文發(fā)現(xiàn)煙草育苗期，條件合適時漂盤基質表面出現(xiàn)大量腐生菌木霉，且生長茂盛，覆蓋育苗基質，在煙苗有傷口的情況下可作為致病菌侵染煙苗。由于育苗基質中腐生木霉的相關研究鮮有報道；為此，煙草育苗基質腐生木霉是否影響煙苗的生長、及如何降低其對煙苗的危害還有待下一步深入研究。此外，本文僅分離出木霉，在育苗基質中的微生物還有很多，下一步有待探究其它微生物的種類和作用，為煙草的健康育苗提供基礎。

微生物碳代謝特征能反應微生物對多種碳源的利用情況，本文通過分析獲得了源自育苗基質的腐生木霉對不同碳源的代謝信息，這些信息為抑制腐生木霉菌的生長及下一步對該類真菌引起病害的防治提供理論依據(jù)。哈茨木霉和棘孢木霉均能夠利用44種碳源，能促進其大量產(chǎn)孢的碳源有赤蘚糖醇、L-海藻糖、乳果糖、麥芽三糖、D-甘露糖、D-松三糖和D-山梨醇；都不能被其利用的碳源有核糖醇、景天庚醛聚糖、蘋果酸等27種碳源。為此，今后煙草育苗基質的選擇，可以考慮選擇富含不能被木霉代謝的載體基質。此外，本文獲得木霉菌的碳源代謝信息為今后其生防菌劑開發(fā)過程中碳源的選擇奠定了基礎。