芮鵬環(huán)，宋培培,2，蔣磊，江彤

1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，合肥 230036；

2 山東省平度市農(nóng)業(yè)局，山東 平度 266700

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員[1]，其基因組含3個(gè)RNA組分，分別為RNA1、RNA2和RNA3， RNA2 3'端ORF編碼2b蛋白，已證明是病毒基因沉默的抑制子[2]。植物通過基因沉默機(jī)制抑制病毒在寄主內(nèi)的積累，抵抗病毒的侵染。為了打破寄主的沉默免疫系統(tǒng)，多數(shù)病毒自身可以編碼RNA沉默抑制子，抑制寄主的沉默防衛(wèi)反應(yīng)，導(dǎo)致植物發(fā)病。基于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）原 理[3-4]，沉默病毒的沉默抑制子，有望提高寄主的抗病性。

目前，利用dsRNA技術(shù)沉默病毒的沉默抑制子已見報(bào)道。將馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）Hc-Pro基因部分片段順次正反向插入植物表達(dá)載體，構(gòu)建的RNAi載體具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化普通煙草（Nicotiana tabacum）品種云煙85，獲得T1代轉(zhuǎn)基因高抗PVY的煙草株系[5]。構(gòu)建蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic viruses，TuMV）HC-Pro基因部分片斷反向重復(fù)植物表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，繼代篩選獲得T3代高抗TuMV的轉(zhuǎn)基因純合擬南芥株系[6]。水稻條紋病毒（Rice stripe virus,RSV）NS2基因和NS3基因編碼的蛋白均具有沉默抑制子功能，將串聯(lián)的NS2+NS3分別正反向插入含有1個(gè)intron的RNAi載體，轉(zhuǎn)化水稻獲得31株T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株，接種RSV發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)病時(shí)間推遲，病毒積累量下降[7]。目前，利用dsRNA技術(shù)沉默CMV沉默抑制子2b基因，獲得轉(zhuǎn)基因抗病毒煙草植株尚未見報(bào)道。本研究擬構(gòu)建CMV2b基因反向重復(fù)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化普通煙草品種云煙85，以獲得能夠穩(wěn)定遺傳的抗CMV轉(zhuǎn)基因煙草株系，為利用基因工程技術(shù)防治CMV提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料采集安徽省蕪湖縣煙區(qū)表現(xiàn)出CMV癥狀的煙草，鑒定后摩擦普通煙草（N.tabacum）作為CMV毒源，烤煙品種云煙85由云南省煙草科學(xué)研究所劉勇研究員惠贈(zèng)，含CMV2b基因的重組載體（pBIN-2b（r, i））由宋培培構(gòu)建[8]，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

CMV 抗血清檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝優(yōu)生物技術(shù)公司，TaqDNA聚合酶購(gòu)自上海生工生物工程公司，T4連接酶和克隆載體pMD18-T購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）公司，DNA消化酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司，RNA抽提試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司，抗生素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他藥品均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pBIN-2b（r, i） T0代轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及PCR檢測(cè)

反向重復(fù)重組載體pBIN-2b（r, i） 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，篩選陽(yáng)性克隆。將云煙85無菌葉片切成0.8×0.8 cm2大小葉盤，置于MS固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，農(nóng)桿菌浸潤(rùn)侵染新鮮葉盤組織，侵染過的葉盤在分化培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織，長(zhǎng)出抗性芽后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生長(zhǎng)，最后移栽盆缽，獲得轉(zhuǎn)基因云煙85植株。提取轉(zhuǎn)基因煙株總RNA，RT-PCR法檢測(cè)靶標(biāo)基因（2b-F: 5'-ATGGAATTGAACGAAGGCGC-3’, 2b-R:5'-T-CAGAACGACCCTTCCG-3’）。

1.2.2 T0代轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性鑒定

稱取CMV感病煙草葉片，按1：10重量體積比加入0.02 mol/L pH 7.2的PBS緩沖液，研磨后作為接種毒源。分別選取5株抗病和感病轉(zhuǎn)基因煙株，以5株非轉(zhuǎn)基因煙株作為對(duì)照，機(jī)械摩擦法接種CMV，15 d后記錄發(fā)病癥狀表型，三抗夾心ELISA（Tas-ELISA）測(cè)定接種煙株的病毒增殖量[9]。

1.2.3 T1代轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性鑒定

云煙85T0代抗病煙株留種，播種擴(kuò)繁T1代煙株，CMV摩擦接種7～8葉期T1代煙株，15 d后觀察煙株發(fā)病癥狀，記錄抗、感病煙株表型，統(tǒng)計(jì)各表型數(shù)量。再提取部分抗、感病T1代煙株的總RNA，選擇煙草Actin蛋白作為內(nèi)參基因（Nt-actin-F: 5’-TG GCTCTTGACTACGAGCAGGAGCTT-3’, Nt-actin-R:5’-ACCACTGAGCAC-AATGTTACCGTAGAGGT-3’），采用Real-time PCR方法，SYBR Green 1染料檢測(cè)轉(zhuǎn)基因云煙85煙株CMV2b基因（2b-RT-F:5’-CGTCGAACTCCAACTGGC-TCGT-3’, 2b-RT-R:5’GAATGGTAGGAAGCGGAACAGCC-3’）的RNA積累水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉盤法轉(zhuǎn)化云煙85

凍融法將pBIN-2b（r, i）導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，葉盤法轉(zhuǎn)化云煙85，卡那霉素抗性篩選，共獲得112株T0代再生煙草植株（圖1）。

圖1 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草Fig.1 Tobacco plants transformed via leaf disc

2.2 T0代轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株的PCR檢測(cè)

CTAB法提取112株T0代轉(zhuǎn)基因煙株DNA，PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，從全部T0代轉(zhuǎn)基因煙株中均能檢測(cè)出大小為530 bp的特異性條帶，轉(zhuǎn)基因煙株陽(yáng)性率達(dá)100%。

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測(cè)Fig.2 PCR detection of the transgenic tobacco plants

2.3 T0代轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性鑒定

將112株T0代轉(zhuǎn)基因煙草依次編號(hào)，分別接種等量CMV，15 d后觀察癥狀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，46個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因煙株不產(chǎn)生任何癥狀，表現(xiàn)為抗病，占41.1%；其他66個(gè)轉(zhuǎn)基因煙株產(chǎn)生不同程度的花葉癥狀，表現(xiàn)為感病，占58.9%；非轉(zhuǎn)基因煙草接種CMV 15 d后，全部出現(xiàn)嚴(yán)重的花葉癥狀（圖3）。

圖3 T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株接種CMV的癥狀表現(xiàn)Fig.3 Symptoms of transgenic T0 transgenic tobacco plants inoculated with CMV

選取T0代轉(zhuǎn)基因抗病煙株和感病煙株各5株，Tas-ELISA檢測(cè)煙株樣本中的病毒含量。結(jié)果表明，5個(gè)抗病煙株的OD405平均值為0.117，顯著低于5個(gè)感病煙株的OD405平均值0.391。轉(zhuǎn)基因感病煙株的OD405和接種CMV的非轉(zhuǎn)基因煙株（CK+）OD405相近，轉(zhuǎn)基因抗病煙株的OD405接近于未接種的非轉(zhuǎn)基因煙株OD405（表1），且轉(zhuǎn)基因抗病煙株的OD405平均值顯著低于轉(zhuǎn)基因感病煙株的OD405。表明轉(zhuǎn)化反向重復(fù)的2b基因確實(shí)可以提高轉(zhuǎn)基因煙株對(duì)CMV的抗性。

表1 T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株接種CMV后的Tas-ELISA檢測(cè)（OD405）Tab.1 Tas-ELISA detection of transgenic T0 tobacco plants inoculated with CMV （OD405）

2.4 T1代轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性鑒定

46株T0代轉(zhuǎn)基因抗病煙株全部留種，隨機(jī)選選擇10個(gè)株系播種，每個(gè)株系移栽30棵苗，7～8葉期接種CMV，15 d后觀察癥狀。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中3個(gè)T1代煙株抗病株率達(dá)100%，7個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因煙株發(fā)生了不同比例的抗感分離，抗病株率為46.7%～80%。非轉(zhuǎn)基因煙株接種CMV的發(fā)病率達(dá)100%（表2）。

表2 T1代轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)CMV的抗性鑒定Tab.2 Resistance identification of transgenic T1 tobacco plants to CMV

續(xù)表2

Real-time PCR檢測(cè)CMV2b基因RNA在T1代轉(zhuǎn)基因煙株的積累水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種CMV后，表現(xiàn)為抗病的轉(zhuǎn)基因煙株和表現(xiàn)為感病的轉(zhuǎn)基因煙株中，CMV2b基因RNA的積累水平差異非常顯著。轉(zhuǎn)基因抗病煙株中CMV2b基因RNA的積累極低，而轉(zhuǎn)基因感病煙株中檢測(cè)到的CMV2b基因RNA積累水平很高。不接種CMV的轉(zhuǎn)基因煙株和非轉(zhuǎn)基因煙株均檢測(cè)不到CMV2b基因RNA的積累（圖4）。結(jié)果表明，T1代轉(zhuǎn)基因煙株的抗病性確實(shí)是由RNA介導(dǎo)的。

圖4 轉(zhuǎn)基因煙株中CMV 2b基因RNA積累水平的Real-time PCR檢測(cè)Fig.4 Real-time PCR detection of CMV 2b RNA accumulation level of transgenic tobacco plants

3 討論

dsRNA誘導(dǎo)的RNA沉默在抗病毒轉(zhuǎn)基因工程中廣泛應(yīng)用，特別是構(gòu)建含有反向重復(fù)序列的載體轉(zhuǎn)化植物，很容易高效轉(zhuǎn)錄獲得dsRNA。Smith等[10]在反向重復(fù)序列之間插入一段內(nèi)含子（intron），轉(zhuǎn)錄后形成dsRNA誘發(fā)基因沉默的效率將近100%。朱俊華等[11]發(fā)現(xiàn)誘發(fā)RNA介導(dǎo)抗性的最短有效基因片段介于202～417 bp之間。因此，本研究也借鑒了這種構(gòu)建策略，克隆了長(zhǎng)度為300～310 bp的2b基因正反向片段，在大豆內(nèi)含子的兩側(cè)分別插入2b基因正反向片段，轉(zhuǎn)化煙草獲得高抗CMV的轉(zhuǎn)基因煙株，表明該構(gòu)建策略具有較好的沉默效果。

Tas-ELISA和Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，CMV侵染轉(zhuǎn)基因抗病煙株，病毒在煙株體內(nèi)的積累量及病毒RNA轉(zhuǎn)錄水平均極低，表明構(gòu)建的表達(dá)載體可以高效沉默CMV2b基因，抵御CMV的侵染。T1代轉(zhuǎn)基因煙株的抗病性鑒定發(fā)現(xiàn)，部分煙草轉(zhuǎn)化株系發(fā)生了不同程度的抗感分離，抗感比率符合3:1，推測(cè)可能是單拷貝株系，而抗性未見分離的，推測(cè)可能是多拷貝株系。抗感分離原因很復(fù)雜，可能與靶基因反向重復(fù)片段的長(zhǎng)度和位置的選擇有關(guān)。另外，外源基因在受體基因組中的插入方式、轉(zhuǎn)基因的甲基化狀況等也對(duì)外源基因的表達(dá)效率有影響[14]。

轉(zhuǎn)基因煙草抗CMV，一般是將CMVcp基因、Rep基因或CMV反義2b基因轉(zhuǎn)入煙草。本研究是將CMV2b基因反向重復(fù)序列插入內(nèi)含子（intron）兩側(cè)，構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，這種重組載體在轉(zhuǎn)錄時(shí)可以剪切掉intron，構(gòu)建的2b（i, r）雙臂結(jié)構(gòu)更為緊湊，不易遭受核酶的攻擊，穩(wěn)定性強(qiáng)；其次，intron剪切的過程不僅有利于互補(bǔ)臂的形成，還有利于轉(zhuǎn)錄水平的提高[12-14]。另外，這種構(gòu)建策略還可以避免病毒異源重組帶來的生態(tài)安全性問題。本研究已得到了T1代轉(zhuǎn)基因抗CMV株系，將分析轉(zhuǎn)基因抗病性遺傳規(guī)律，繼代篩選T2代、T3代抗病株系，直到獲得高抗CMV的單拷貝純合株系。