乳酸片球菌AS1.2696來源的α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)分析

郭雙雙，鄭芳芳，可叢雪，王子龍，韋宇拓，黃日波，杜麗琴*

（廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005）

鼠李糖苷酶以L-鼠李糖苷酶為主，L-鼠李糖苷酶又可分為α-L-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.40）和β-L-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.43）。α-L-鼠李糖苷酶可將α-鼠李糖苷鍵的非還原端水解[1]，可以作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α-1連接的糖苷鍵[2]，如柚皮苷[3-5]、新橙皮苷、柴胡皂苷C、橙皮苷[6]、蘆丁[7]和槲皮苷等物質(zhì)末端的α-L-鼠李糖基[8]。Lise等[9]從Novospingobium sp. PP1Y中得到一個對α-1,2、α-1,6均有較好水解效果的鼠李糖苷酶。

CAZY根據(jù)氨基酸序列的相似性和疏水簇分析，將α-L-鼠李糖苷酶劃分為GH13、GH28、GH78和GH106家族[10]。目前報道較多的為GH78家族[10-13]，GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶大多來源于真菌（如曲霉屬和青霉屬等）[14]和細(xì)菌[15]。Ishikawa等[16]從Aspergillus oryzae中克隆得到的α-L-鼠李糖苷酶最適酶反應(yīng)溫度為70 ℃。來源于Aspergillus terreus的α-L-鼠李糖苷酶在溫度為70 ℃時，仍具有較好的耐受性[17]。Li Lijun等[18]從Aspergillus niger JMU-TS528中發(fā)現(xiàn)1 株能夠耐葡萄糖和乙醇的鼠李糖苷酶。Qian Siriguleng等[19]從新鮮牛肝中分離純化分子質(zhì)量大小為75 kDa的薯蕷皂苷-α-L-鼠李糖苷酶，該酶的最適酶反應(yīng)pH值為7.0，最適溫度為42 ℃，Mg2＋對該酶具有激活作用。Birgisson等[15]從一種新型嗜熱細(xì)菌中克隆了2 個α-L-鼠李糖苷酶并進行重組表達，研究證明兩個重組酶RhmA和RhmB的分子質(zhì)量大小為104 kDa和107 kDa，當(dāng)溫度達到70 ℃時2 個重組酶均具有較好的耐受性，RhmA和RhmB對對硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside，pNPR）的Km分別為 0.46 mmol/L和0.66 mmol/L，Vmax分別為134 U/mg和352 U/mg。這兩個α-L-鼠李糖苷酶還能夠水解α-1,2和α-1,6連接的β-D-葡萄糖苷。

α-L-鼠李糖苷酶具有廣泛的應(yīng)用價值與前景。在食品飲料方面，α-L-鼠李糖苷酶可水解柚皮苷，用于飲料果汁的脫苦[20-21]，改善飲品的風(fēng)味。在醫(yī)藥方面，通過水解柚皮苷來獲得應(yīng)用價值更廣更好的普魯寧[3,22-24]；異槲皮素作為蘆丁水解掉一個末端鼠李糖的產(chǎn)物，其相較于蘆丁具有更好的醫(yī)療效果和利用率[25]，如韓冰[26]、Gerstorferová[17]、Yadav[27]等分別得到中能夠高效轉(zhuǎn)化蘆丁生成異槲皮素的重組菌株。其他水解活性的應(yīng)用，α-L-鼠李糖苷酶還可應(yīng)用于水解淫羊藿苷類物質(zhì)，增加活性苷元的含量[28-29]。

本研究中乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）AS1.2696已經(jīng)全基因組測序，通過對全基因組序列分析，查找到2 個注釋為α-L-鼠李糖苷酶的基因序列。對這2 個基因序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個基因序列的一致性為44.6%，編碼蛋白質(zhì)的序列一致性只有17.8%，一致性比較低，于是克隆表達菌株中的2 個α-L-鼠李糖苷酶基因，純化目的蛋白，研究這2 個重組酶的酶學(xué)性質(zhì)以及底物特異性，以期挖掘其在一些天然類底物的水解功能及潛在的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸片球菌AS1.2696由本實驗室保藏。

限制性內(nèi)切酶 大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒 北京BioFlux公司；Ni-NTA填料德國Qiagen公司；pNPR、4-硝基苯基-β-D-阿拉伯糖苷（4-nitrophenyl-β-L-arabinoside，pNPA）等對硝基苯基底物美國Sigma公司；柚皮苷、新橙皮苷 阿拉丁生化科技股份有限公司；橙皮苷、蘆丁 生工生物工程（上海）股份有限公司；淫羊藿苷類物質(zhì)、槲皮苷、楊梅苷、柴胡皂苷C 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biomertra T-Gradient Thermoblock聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國耶拿分析儀器股份公司；Centrifuge 5415D離心機 德國Eppendorf公司；G1314F-1260VWD高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；ZHWY-211B恒溫?fù)u床 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 德國Binder公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞破碎機 寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 α-L-鼠李糖苷酶基因prha2及prha3的克隆

從數(shù)據(jù)庫中，查找到乳酸片球菌AS1.2696中含有2 個已經(jīng)注釋為鼠李糖苷酶的基因序列，分別將其命名為prha2及prha3。使用SMART軟件分別對其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組件進行分析，并使用SignalP4.1進行信號肽的預(yù)測。以pSE380為表達載體，設(shè)計含有6×His標(biāo)簽的引物，以乳酸片球菌AS1.2696的總DNA為模板，PCR擴增鼠李糖苷酶完整基因prha2及prha3。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，DNA測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

prha2基因擴增的引物：PA1-1：5’-ACGCCATGGA ACATCATCATCATCATCATATGGCATTTACATTTCA AATTAATG-3’（引入酶切位點NcoI，和組氨酸標(biāo)簽。加粗表示酶切位點，下劃線表示組氨酸標(biāo)簽）；PA1-2：5’-GGCGAGCTCCTAACTTAAATACTTTCTCATTA AG-3’（引入酶切位點SacI）。

prha3基因擴增的引物：PA2-1：5’-ACGCCATGG AACATCATCATCATCATCATATGAATCAAACTTATT GGATCTG-3’（引入酶切位點NcoI，和組氨酸標(biāo)簽）；PA2-2：5’-GTCGAGCTCTCACGCAATGGGAATTACT ACGGPCR-3’（引入酶切位點SacI）。

反應(yīng)程序：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，57.6 ℃、30 s，72 ℃、2 min，進行30 個循環(huán)；72 ℃、10 min。將PCR產(chǎn)物純化并酶切處理后連接至經(jīng)過同樣酶切處理的pSE380表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL1-blue中經(jīng)過測序。將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為pSE-prha2、pSE-prha3。

1.3.2 重組酶PRHA2和PRHA3的誘導(dǎo)表達及純化

將菌株于37 ℃培養(yǎng)，使菌液OD600nm達到0.4～0.6，再加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）進行誘導(dǎo)，在最佳誘導(dǎo)條件下進行誘導(dǎo)一定時間后，離心收集菌體。超聲波破胞后，通過鎳親和層析純化重組酶PRHA2和PRHA3。并對純化后的重組酶進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.3.3 重組酶PRHA2和PRHA3酶學(xué)性質(zhì)分析

鼠李糖苷酶酶活力單位（U）的定義：在最適酶反應(yīng)條件下，每分鐘催化1 μmol底物（pNPR）轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）所需要的酶量。酶活力測定方法：酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系是由緩沖液、底物、酶液組成200 μL體系，170 μL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、20 μL 10 mmol/L的pNPR先在最適酶反應(yīng)溫度下預(yù)熱2 min，加入10 μL適當(dāng)稀釋的酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)20 min后，加入50 μL 2 mol/L Na2CO3溶液終止酶反應(yīng)。以不加酶的反應(yīng)管為空白對照?；靹蚝笕?00 μL反應(yīng)液至酶標(biāo)板中，在405 nm波長下讀取吸光度。

1.3.3.1 最適酶反應(yīng)pH值的測定

在37 ℃條件下，測定不同pH值（3.0～8.0）的0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液對重組酶活力的影響，以最高活力為100%，計算在各個pH值下重組酶的相對活力，相對活力最高對應(yīng)的pH值即為該酶的最適反應(yīng)pH值。

1.3.3.2 最適酶反應(yīng)溫度的測定

在最適酶反應(yīng)pH值條件下，測定酶在不同溫度下（25～80 ℃）的酶活力，以最高活力為100%，計算各個溫度下重組酶的相對活力，相對活力最高對應(yīng)的溫度即為該酶的最適反應(yīng)溫度。

1.3.3.3 重組酶的動力學(xué)常數(shù)測定

在最適酶反應(yīng)條件下，測定酶在以0.1～9.0 mmol/L一系列不同濃度的pNPR為底物時的比活力，使用軟件GraphPad Prism 5通過非線性回歸分析擬合出重組酶的Km、Vmax值。

1.3.3.4 重組酶pH值穩(wěn)定性的測定

將重組酶于4 ℃在一系列不同pH值的緩沖液中保存12 h，然后在最適反應(yīng)條件下測定其殘存酶活力，以保存在pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中的純酶活力為100%，計算各個pH值下重組酶的相對活力。

1.3.3.5 重組酶熱穩(wěn)定性的測定

將重組酶保存在一系列不同溫度下1 h，立即取出放于冰上，在最適反應(yīng)條件下測定其殘存酶活力，以保存在冰箱4 ℃的純酶活力為100%，計算各個溫度下重組酶的相對活力。

1.3.3.6 化學(xué)試劑對酶活力的影響

在最適反應(yīng)條件下，在反應(yīng)體系中加入一定量的化學(xué)試劑（0.05 g/100 mL十二烷基硫酸鈉、1%曲拉通（TritonX-100）、4 mol/L脲、0.01 mol/L咪唑、1%巰基乙醇、5%吐溫-80），測定重組酶的殘存酶活力。以不添加化學(xué)試劑的反應(yīng)管酶活力為100%，計算各種化學(xué)試劑下酶的相對活力。

1.3.3.7 有機試劑對重組酶酶活力的影響

在最適反應(yīng)條件下，在反應(yīng)體系中分別添加體積分?jǐn)?shù)5%～30%的醇類及有機溶劑（醇類：甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、乙二醇、1,3-丙二醇；有機溶劑：二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四氫呋喃、吡啶、乙腈），測定重組酶的殘存酶活力。以不添加有機試劑的反應(yīng)管酶活力為100%，計算各有機試劑下酶的相對活力。

1.3.3.8 酶底物特異性的測定

人工底物：取合適的底物濃度，以及適當(dāng)稀釋的酶液，在最適反應(yīng)條件下進行酶活力的測定。以pNP或oNP的生成量來計算酶活力，以pNPR作為底物時的酶活力為100%。測定的底物包括pNPR、鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，oNPG）、4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenylβ-D-galactopyranoside，pNPGal）、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG）、4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，α-pNPG）、對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX）、4-甲基傘形酮-β-D-葡糖苷酸（4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide，MU-Glc）、4-硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-2-Acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside，pNPNAG）、4-硝基苯基-β-L-阿拉伯糖苷（4-nitrophenyl-β-L-arabinopyranoside，pNPA）、4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷（4-nitrophenyl-β-D-cellobioside，pNPC）。

二糖及糖苷類：以終質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的乳糖、纖維二糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、海藻糖、苦杏仁苷、水楊苷分別作為底物，與純酶在最適條件下反應(yīng)測定酶活力。反應(yīng)20 min后，煮沸終止5 min，利用葡萄糖氧化試劑盒測定反應(yīng)管中葡萄糖的生成量，依次計算酶活力。

多糖類物質(zhì)：以終質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的羧甲基纖維素鈉、淀粉、蔗渣木聚糖、山毛櫸木聚糖分別作為底物，與純酶在最適條件下反應(yīng)測定酶活力。反應(yīng)6 h后，加入400 μL 3,5-二硝基水楊酸終止酶反應(yīng)，煮沸反應(yīng)管顯色5 min?；靹蚝笕?00 μL反應(yīng)液至酶標(biāo)板中，于540 nm波長下讀取吸光度。根據(jù)還原糖的生成量來計算酶活力。

其他底物特異性以終質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL的柚皮苷、新橙皮苷、蘆丁、橙皮苷、槲皮苷、楊梅苷、柴胡皂苷C分別作為底物，與純酶在最適條件反應(yīng)12 h后，煮沸終止5 min。用50%乙腈稀釋10 倍，12 000 r/min離心30 min，取上清液利用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物。

對淫羊藿類物質(zhì)的水解作用：以終質(zhì)量濃度為100 μg/μL的淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、寶藿苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C分別作為底物，于純酶在最適酶反應(yīng)條件反應(yīng)12 h后，煮沸終止5 min。用50%乙腈稀釋3 倍，12 000 r/min離心30 min，取上清液利用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物。HPLC檢測條件：安捷倫1260系列液相色譜儀，色譜柱：C18柱，進樣量：10 μL，柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min，檢測波長：270 nm。流動相：乙腈（A），水（B）。梯度洗脫：0～5 min，32% A；5～12 min，80% A；12～17 min，80% A；17～20 min，32% A；20～25 min，32% A。

1.3.4 重組酶的糖基轉(zhuǎn)移活性的測定

糖類：以16 g/100 mL鼠李糖為鼠李糖基供體，20 g/100 mL的糖類或糖醇類為受體，加入重組酶反應(yīng)12 h（PRHA2在55 ℃下反應(yīng)，PRHA3在40 ℃下反應(yīng)），煮沸5 min終止酶反應(yīng)，12 000 r/min離心30 min，HPLC檢測反應(yīng)產(chǎn)物。HPLC檢測條件：示差折光檢測器；色譜柱：NH2柱；進樣量：20 μL；流速：1 mL/min；流動相：70%乙腈，等度洗脫。

醇類：以16 g/100 mL鼠李糖為鼠李糖基供體，分別以10%的乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇，15%的甲醇和20%的乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、丙三醇為受體，加入重組酶反應(yīng)12 h（PRHA2在55 ℃下反應(yīng)，PRHA3在40 ℃下反應(yīng)），煮沸5 min終止酶反應(yīng)，12 000 r/min離心30 min， HPLC檢測反應(yīng)產(chǎn)物。HPLC檢測條件：示差折光檢測器；色譜柱：NH2柱；進樣量：20 μL；流速：1 mL/min；流動相：83%乙腈，等度洗脫。

長鏈醇類：在重組酶的最適反應(yīng)pH值條件下，以鼠李糖作為鼠李糖基供體，己醇、辛醇、壬醇、癸醇分別作為糖基受體，與純酶在搖床220 r/min反應(yīng)12 h后，煮沸終止5 min。12 000 r/min離心30 min，取有機相利用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物（體系：2.4 mL長鏈醇＋150 μL 40 g/100 mL的鼠李糖＋150 μL緩沖液＋150 μL酶液）。HPLC檢測條件：蒸發(fā)光檢測器；色譜柱：C18柱，進樣量：20 μL，流速：0.8 mL/min；流動相：75%甲醇，等度洗脫。

烷基糖苷類：在重組酶的最適反應(yīng)pH值條件下，以16 g/100 mL鼠李糖作為鼠李糖基供體，1 g/100 mL的己基-β-D-葡萄糖苷、庚基-β-D-葡萄糖苷、n-辛基-β-D-葡萄糖苷、壬基-β-D-葡萄糖苷、癸基-β-D-葡萄糖苷分別作為糖基受體，與純酶反應(yīng)12 h后，煮沸終止5 min。用超純水分別稀釋20 倍和100 倍，12 000 r/min離心30 min，取上清液利用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物。HPLC檢測條件：蒸發(fā)光檢測器；色譜柱：C18柱；進樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min；流動相：75%甲醇，等度洗脫。

咖啡酸：在重組酶的最適反應(yīng)pH值條件下，以16 g/100 mL鼠李糖作為鼠李糖基供體，1 g/100 mL咖啡酸作為糖基受體，與純酶反應(yīng)12 h后，煮沸終止5 min。用50%乙腈稀釋10 倍，12 000 r/min離心30 min，取上清液利用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物。HPLC檢測條件：色譜柱：C18柱；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：327 nm；流動相：乙腈（A），2%乙酸溶液（B）；等度洗脫：A∶B=85∶15（V/V）。

苯甲酸：在重組酶的最適反應(yīng)pH值條件下，以16 g/100 mL鼠李糖作為鼠李糖基供體，0.5 g/100 mL苯甲酸作為糖基受體，與純酶反應(yīng)12 h后，煮沸終止5 min。用50%乙腈稀釋50 倍，12 000 r/min離心30 min，取上清液利用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物。HPLC檢測條件：色譜柱：C18柱，進樣量：10 μL；流速：1 mL/min；檢測波長：230 nm；流動相：甲醇（A），20 mmol/L乙酸銨（B）；等度洗脫：A∶B=5∶95（V/V）。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

重組酶的酶學(xué)性質(zhì)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5進行處理，動力學(xué)常數(shù)使用軟件GraphPad Prism 5通過非線性回歸分析擬合出重組酶的Km、Vmax值。圖像采用Microsoft Office Visio 2003進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 AS1.2696中prha2及prha3鼠李糖苷酶基因的克隆

2.1.1 α-L-鼠李糖苷酶基因prha2及prha3的序列分析

圖1 PRHA2和PRHA3的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組件及信號肽分析Fig. 1 Analysis of protein domains and signal peptide sequences in PRHA2 and PRHA3

本研究從實驗室保存的1 株已經(jīng)完成基因組測序的乳酸片球菌AS1.2696出發(fā)，分析其基因組數(shù)據(jù)，從中查找到兩個被注釋為α-L-鼠李糖苷酶的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。其中一個的ORF全長1 578 bp，由ATG起始TAG終止，編碼了一個長度為525 個氨基酸的蛋白質(zhì)。將該ORF命名為prha2，將其編碼的蛋白質(zhì)命名為PRHA2。對PRHA2的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組件進行SMART分析，PRHA2含有一個low complexity功能域和一個Bac_rhamnosid功能域（圖1A）。同時，結(jié)合SignalP4.1進行信號肽分析，表明PRHA2不含信號肽序列（圖1B）。對PRHA2進行理化參數(shù)的計算，結(jié)果顯示PRHA2的理論分子質(zhì)量為60 460.84 Da，理論等電點pI為5.05。

另一個ORF全長1 962 bp，由ATG起始TGA終止，編碼了一個長度為653 個氨基酸的蛋白質(zhì)。將該ORF命名為prha3，將其編碼的蛋白質(zhì)命名為PRHA3。對PRHA3的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組件進行SMART分析，PRHA3含有一個Bac_rhamnosid功能域（圖1C）。同時，結(jié)合SignalP4.1分析信號肽，表明PRHA3不含信號肽序列（圖1D）。對PRHA3進行理化參數(shù)的計算，結(jié)果顯示PRHA3的理論分子質(zhì)量為75 959.45 Da，理論等電點pI為6.10。

2.1.2 α-L-鼠李糖苷酶基因prha2及prha3的克隆和重組表達

圖2 瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 2 Agarose gel electrophoresis analysis

提取菌株乳酸片球菌AS1.2696的總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2A所示。以pSE380為表達載體，設(shè)計含有6×His標(biāo)簽的引物，以AS1.2696的總DNA為模板，PCR擴增基因prha2及prha3。電泳檢測后，結(jié)果如圖2B所示，分別成功擴增到一條約為1.5 kb及1.9 kb的DNA條帶，片段大小與預(yù)期相符。

目的基因經(jīng)用NcoI和SacI雙酶切后與同樣經(jīng)NcoI和SacI雙酶切的pSE380載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSE-prha2及pSE-prha3。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）XL1-Blue，提取質(zhì)粒，用NcoI和SacI雙酶切處理質(zhì)粒。結(jié)果如圖2C所示，重組質(zhì)粒pSE-prha2及pSE-prha3雙酶切后產(chǎn)生兩條帶，與預(yù)期大小相符，表明目的基因prha2及prha3已經(jīng)連入載體pSE380。

2.1.3 重組酶PRHA2和PRHA3的誘導(dǎo)表達和純化

圖3 純化產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purified PRHA2 and PRHA3

由圖3可知，相較于對照菌株，誘導(dǎo)后的重組菌株分別在預(yù)期大小處出現(xiàn)明顯的蛋白質(zhì)特征性條帶，且純化后的蛋白質(zhì)溶液在相應(yīng)位置也出現(xiàn)蛋白質(zhì)特征性條帶，表明成功表達且純化到目的蛋白質(zhì)PRHA2和PRHA3。純化后的蛋白條帶較為明顯，可用于下一步的研究。

2.2 PRHA2和PRHA3基本酶學(xué)性質(zhì)的鑒定

2.2.1 PRHA2和PRHA3最適反應(yīng)pH值

結(jié)果表明，PRHA2的最適酶反應(yīng)pH值為5.0（圖4A），PRHA3的最適酶反應(yīng)pH值為5.5（圖4B）。

圖4 pH值對PRHA2（A）和PRHA3（B）酶活力的影響Fig. 4 Effect of pH on the activity of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.2 PRHA2及PRHA3最適反應(yīng)溫度

結(jié)果表明，PRHA2的最適酶反應(yīng)溫度為60 ℃（圖5A），PRHA3的最適酶反應(yīng)溫度為45 ℃（圖5B）。

圖5 溫度對PRHA2（A）和PRHA3（B）酶活力的影響Fig. 5 Effect of temperature on the activity of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.3 PRHA2及PRHA3 pH值穩(wěn)定性

在pH 5.5～8.0的緩沖液內(nèi)4 ℃放置12 h后，重組酶PRHA2活力仍保持在80%以上，說明在此范圍內(nèi)該酶具有較好的pH值穩(wěn)定性（圖6A）；在pH 4.0～8.5的緩沖液內(nèi)4 ℃放置12 h后，重組酶PRHA3活力仍保持在80%以上，說明在此范圍內(nèi)該酶具有較好的pH值穩(wěn)定性（圖6B）。

圖6 PRHA2（A）和PRHA3（B）的pH值穩(wěn)定性Fig. 6 pH stability of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.4 PRHA2及PRHA3溫度穩(wěn)定性

在溫度25～45 ℃的溫度范圍保溫1 h后，重組酶PRHA2活力仍保持在80%以上，說明在此范圍內(nèi)該酶具有較好的溫度穩(wěn)定性（圖7A）。在25～35℃的溫度范圍保溫1 h后，重組酶PRHA3活力仍保持在80%以上，說明在此范圍內(nèi)該酶具有較好的溫度穩(wěn)定性（圖7B）。

圖7 PRHA2（A）和PRHA3（B）熱穩(wěn)定性Fig. 7 Thermal stability of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.5 PRHA2及PRHA3的動力學(xué)常數(shù)

分別測定PRHA2（pH 5.0、60 ℃）及PRHA3（pH 5.5、45 ℃）在以0.1～9 mmol/L不同濃度的pNPR為底物時的酶活力（每個濃度做3 個重復(fù)）。利用軟件GraphPad Prism 5通過非線性回歸擬合出PRHA2的Km和Vmax值分別為（3.039±0.581）mmol/L和（2.032±0.186）μmol/（min·mg）（圖8A）。PRHA3的Km和Vmax值分別為（2.797±0.132）mmol/L和（113.35±1.485）μmol/（min·mg）（圖8B）。

圖8 PRHA2（A）和PRHA3（B）的Km和Vmax值Fig. 8 Determination of Km and Vmax of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.6 化學(xué)試劑對PRHA2及PRHA3酶活力的影響

0.05 g/100 mL十二烷基硫酸鈉和4 mol/L脲能夠強烈抑制PRHA2，1% TritonX-100及0.01 mol/L 咪唑?qū)RHA2略有抑制作用，5%吐溫-80和1%巰基乙醇對PRHA2有較強的抑制作用（圖9A）。0.05 g/100 mL十二烷基硫酸鈉和4 mol/L脲能夠使PRHA3失活，1% TritonX-100對PRHA3酶活力影響不大，0.01 mol/L咪唑、5%吐溫-80和1%巰基乙醇對PRHA3有不同程度的抑制作用（圖9B）。

圖9 化學(xué)試劑對PRHA2（A）和PRHA3（B）酶活力的影響Fig. 9 Effects of chemical reagents on the activity of PRHA2 (A) and PRHA3 (B)

2.2.7 有機試劑對PRHA2及PRHA3酶活力的影響

整體上看，各種有機試劑對PRHA2均有一定的抑制作用，且抑制程度與添加量相關(guān)，添加量越高，對PRHA2的抑制作用越強（圖10A～C）。另外，乙二醇對PRHA2酶活力的抑制不強，在添加量為10%時仍保持有40%左右的酶活力；而其他幾種有機試劑對PRHA2酶活力的抑制較為明顯。隨著有機溶劑的添加量增大，其對PRHA2的抑制作用越強，這幾種有機溶劑對PRHA2有強烈的抑制作用。

整體上看，各種有機試劑對PRHA3均有一定的抑制作用，且抑制程度與添加量相關(guān)，添加量越高，對PRHA3的抑制作用越強（圖10D～F）。另外，乙二醇及1,3-丙二醇對PRHA3酶活力的抑制不強，在添加量為20%時仍保持有40%左右的酶活力；而其他幾種有機試劑對PRHA3酶活力的抑制較為明顯。隨著有機溶劑的添加量增大，其對RHA3的抑制作用越強且這幾種有機溶劑對PRHA3的抑制作用較強。

圖10 有機試劑對PRHA2及PRHA3酶活力的影響Fig. 10 Effects organic reagents on the activity of PRHA2 and PRHA3

2.2.8 PRHA2及PRHA3的底物特異性分析

從表1可以發(fā)現(xiàn)，PRHA2對pNPA有一定的水解活性，對其他芳香類糖苷底物及二糖底物沒有活性或僅有微弱活性。PRHA3這些芳香類糖苷底物及二糖底物沒有活性或僅有微弱活性。

表1 重組酶PRHA2及PRHA3的底物特異性Table 1 Substrate specificity of PRHA2 and PRHA3

2.2.9 其他底物水解特異性分析

表2結(jié)果表明，兩種重組酶均只能水解橙皮苷及蘆丁，這兩種物質(zhì)均為β-Glc-(6→1)-α-Rha糖苷鍵的物質(zhì)。

表2 重組酶PRHA2和PRHA3的底物特異性Table 2 Substrate specificity of PRHA2 and PRHA3

2.2.10 重組酶對淫羊藿類物質(zhì)的水解作用

從表3可看出，PRHA2對淫羊藿類物質(zhì)均沒有水解作用。PRHA3對淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C這幾種物質(zhì)C-7位的葡萄糖糖苷鍵有較弱的水解作用。值得注意的是，PRHA3能夠水解朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha外側(cè)的鼠李糖糖苷鍵，即PRHA3能夠水解以α-Rha(2→1)α-Rha外側(cè)的鼠李糖糖苷鍵，但不能水解以β-Glc(2→1)-α-Rha外側(cè)的鼠李糖糖苷鍵。

表3 重組酶PRHA2、PRHA3作用于淫羊藿類物質(zhì)的底物特異性Table 3 Substrate specificity of PRHA2 and PRHA3 toward icariins

2.3 重組酶的糖基轉(zhuǎn)移活性

以16 g/100 mL鼠李糖為鼠李糖基供體，HPLC分析轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，PRHA2分別以葡萄糖、纖維二糖為受體的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)物中，檢測到低含量的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物。PRHA3分別以半乳糖、乳糖為受體的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)物中，檢測到低含量的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物。PRHA2在以鼠李糖為鼠李糖基供體，以己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷為受體的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)物中，檢測到低含量的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物，表明重組酶PRHA2對以上化合物具有轉(zhuǎn)糖苷功能。PRHA2和PRHA3在以鼠李糖為鼠李糖基供體，各類短碳鏈的醇基糖醇類物質(zhì)、長鏈醇類、咖啡酸、苯甲酸為受體的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)物中，均未檢測到轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物。

3 結(jié)論與討論

從乳酸片球菌AS1.2696中擴增得到2 個α-L-鼠李糖苷酶基因prha2和prha3，其基因大小分別為1 578 bp、1 962 bp，分別編碼525 個和653 個氨基酸。以pSE380為表達載體在E. coliXL1-blue中表達目的基因，通過鎳親和層析純化重組蛋白，測定重組酶的酶學(xué)性質(zhì)。

PRHA2的最適pH值和最適溫度分別為5.0和60 ℃；PRHA3的最適pH值和最適溫度分別為5.5和45 ℃。兩個重組酶的最適酶反應(yīng)pH值均偏酸性，與大多數(shù)鼠李糖苷酶一致，酶的最適pH值為4～7，少數(shù)pH值大于7；最適酶反應(yīng)溫度差異較大，多數(shù)在40～60 ℃之間，少數(shù)在70 ℃或以上[1,17-18,27,30-34]。兩個重組酶雖然來自同一個菌株，但其最適酶反應(yīng)溫度差異較大。PRHA2的Km值為（3.039±0.581）mmol/L，Vmax值為（2.032±0.186）μmol/（min·mg）；PRHA3的Km值為（2.797±0.132）mmol/L，Vmax值為（113.35±1.485）μmol/（min·mg）。各種化學(xué)試劑和有機試劑對兩個重組酶均有不同程度的抑制作用。

對PRHA2和PRHA3的底物特異性進行研究，發(fā)現(xiàn)PRHA2和PRHA3不僅能夠水解人工底物pNPR，還能夠水解α-1,6鍵的天然底物橙皮苷、蘆??；PRHA3還能夠水解朝藿定C。除此之外，重組酶還具有較弱的轉(zhuǎn)糖苷功能，α-L-鼠李糖苷酶催化糖苷鍵的合成，在合成烷基糖苷、低聚寡糖等方面具有潛在的價值[35]。

橙皮苷在水中幾乎不溶，水解橙皮苷，生成橙皮素葡萄糖苷和鼠李糖，而橙皮素葡萄糖苷是天然的甜味劑前體物。蘆丁在藥理作用和吸收效果等方面也不如其水解產(chǎn)物異槲皮素，本研究中，PRHA2和PRHA3對橙皮苷和蘆丁具有較好的水解能力，兩個重組酶對蘆丁的催化效率高于橙皮苷，且PRHA3對蘆丁和橙皮苷的催化效率高于PRHA2。

淫羊藿的主要成分包括黃酮類化合物、木脂素、生物堿、揮發(fā)油等，其中黃酮類化合物主要包括淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等。而PRHA3能夠水解淫羊藿中的朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha連接的外側(cè)的鼠李糖，從而生成淫羊藿苷，目前尚鮮有文獻報道有α-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C制備淫羊藿苷。淫羊藿苷相較于朝藿定C更容易被人體吸收，而且淫羊藿苷及其進一步的水解產(chǎn)物在抗腫瘤方面具有重要作用[36]，其苷元脫水淫羊藿素目前已進入臨床研究階段。根據(jù)重組酶對淫羊藿類物質(zhì)的水解結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRHA3能夠水解以α-Rha(2→1)α-Rha連接的外側(cè)的鼠李糖，但不能水解以β-Glc(2→1)-α-Rha連接的外側(cè)的鼠李糖，可針對這一特點進一步研究PRHA3水解糖苷鍵的成鍵方式。

與其他糖苷酶相比，鼠李糖苷酶的分子結(jié)構(gòu)及其功能了解仍有很多不足，本研究構(gòu)建的2 個α-L-鼠李糖苷酶均來自乳酸片球菌AS1.2696，但重組酶PRHA2和PRHA3的基本酶學(xué)性質(zhì)、底物特異性等各方面的差異均較大，豐富了α-L-鼠李糖苷酶的資源。