基于氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)與多元統(tǒng)計分析對不同栗香特征綠茶判別分析

尹洪旭，楊艷芹，姚月鳳，張銘銘，王家勤，江用文，袁海波,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 浙江省茶葉加工工程重點實驗室，浙江 杭州 310008；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

茶葉香氣是決定名優(yōu)茶品質(zhì)的重要因子之一，協(xié)調(diào)而愉快的香氣不僅是評價名優(yōu)綠茶等級的標(biāo)準(zhǔn)，也是消費者選擇的重要依據(jù)。栗香是優(yōu)質(zhì)綠茶所擁有的特征香型之一，主要表現(xiàn)為熟栗子或嫩玉米的香氣特色，與鮮葉品種、原料品質(zhì)和加工工藝等有關(guān)。隨著感官技術(shù)的日趨成熟和細(xì)化，根據(jù)栗香香型表現(xiàn)、香氣強度等感官表征上的差異，現(xiàn)代感官評審中又將栗香細(xì)分為嫩栗香、板栗香、熟栗香等不同香型[1-3]。板栗香是一種基于特定品種的堅果香氣，多見于制作中火功恰到好處的高檔綠茶及個別品種茶[4]；嫩栗香是在栗香風(fēng)味的基礎(chǔ)上，突顯柔和、新鮮幽雅的毫茶香，多見于原料幼嫩、采制精細(xì)的高檔綠茶；熟栗香一般在足火的加工條件下，形成一種由栗香到高火香過渡的香氣特征。

目前茶葉香型的辨別主要依靠人工感官審評，結(jié)果存在個體誤差且需要豐富的經(jīng)驗。因此，為使不同栗香特征的綠茶分類更科學(xué)直觀，利用現(xiàn)代儀器分析對茶葉香氣進行分析檢測，結(jié)合多元統(tǒng)計分析技術(shù)，對栗香綠茶香氣品質(zhì)進行評價和預(yù)測是行之有效的方法。主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）是目前食品領(lǐng)域比較常見的多元統(tǒng)計技術(shù)，廣泛應(yīng)用于白酒[5-6]、龍眼[7]、橄欖油[8]等食品真假判別、質(zhì)量評價[6]和年份產(chǎn)地鑒別[9]等方面。Jumtee等[10]采用真空水蒸餾法-質(zhì)譜聯(lián)用分析日本煎茶的香氣組分，通過PLSDA與茶葉感官評價建立回歸，實現(xiàn)了對不同煎茶等級的有效區(qū)分，并得到15 種對日本煎茶香氣品質(zhì)貢獻大的香氣組分。本研究將PCA、PLS-DA和HCA多元統(tǒng)計方法用于對不同栗香特征綠茶的香氣特征判別分析，并探索其相關(guān)性大的香氣物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同栗香風(fēng)味綠茶共有18 個，其中嫩栗香7 個，熟栗香5 個，板栗香6 個，樣品具體信息如表1所示。

表1 栗香型綠茶樣品信息Table 1 Detailed information about chestnut-like green tea

1.2 儀器與設(shè)備

7000C-7890B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；250 mL自制頂空微萃取瓶、固相微萃?。╯olid phase micro extraction，SPME）手柄、DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supe1co公司；電加熱磁力攪拌恒溫夾套 無錫順潤公司；NaCl溶液（1 mg/mL） 山東佰鴻有限公司；癸酸乙酯 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官審評

建立5 人感官審評小組，3 男2 女，小組成員均具有國家中級評茶員及以上資質(zhì)的專業(yè)人員。感官審評標(biāo)準(zhǔn)依照茶葉感官審評方法GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》沖泡[11]，主要對綠茶香氣特征進行審評，審評順序為熱嗅香氣、溫嗅香氣、冷嗅香氣，具體方法：撮取3 g茶倒入審評杯內(nèi)，用沸水（100℃）充至杯滿（約150 mL）為止，浸泡4 min，隨后將茶湯瀝入審評碗內(nèi)，聞其杯內(nèi)香氣，評其術(shù)語，判斷香型。審評結(jié)果由審評小組一致通過獲得，反復(fù)3 次，遵循少數(shù)服從多數(shù)原則，最后確定其香氣類型。

1.3.2 樣品前處理

稱取10.0 g茶樣放入250 mL三角瓶中，沖入100 ℃超純水100 mL（物料比1∶10），加入1 mg/mL NaCl電解質(zhì)溶液和癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)物，用已打孔的橡皮塞（經(jīng)丙酮浸泡12 h，去味）塞緊，磁力攪拌速率450 r/min，在60 ℃恒溫夾套內(nèi)攪拌加熱，水浴平衡5 min后，將裝有DVB/CAR/PDMS萃取頭（實驗前老化5 min）的SPME手持器透過瓶蓋的橡皮塞插入自制頂空微萃取瓶，于茶湯液面上空吸附60 min，萃取完成后迅速將萃取頭放入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行熱脫附解吸。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：采用D B-5 M S毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），進樣口溫度：230 ℃，柱流速： 1 mL/min，不分流。程序升溫參數(shù)：50 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升到230 ℃，保持2 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，轉(zhuǎn)接口溫度280 ℃，電子倍增器電壓350 V，質(zhì)量掃描范圍35～400 u。

1.3.4 定性分析

定性分析通過安捷倫自動質(zhì)譜解卷積定性系統(tǒng)，解卷積參數(shù)峰寬設(shè)為20，分辨率、靈敏度及色譜峰形的要求均設(shè)為中等，匹配因子最小值設(shè)置為80，譜圖檢索NIST14，同時結(jié)合文獻輔助定性。定量分析通過化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法進行計算，求出各組分的相對含量。質(zhì)量控制：加入癸酸乙酯對整個萃取和檢測過程進行監(jiān)控，保證每個樣品圖中癸酸乙酯峰的保留時間變化率不超過1%，且峰面積變化率不超過10%。

計算各揮發(fā)物的保留指數(shù)（rentention index，RI），以正構(gòu)烷烴混合物（C5～C26）為標(biāo)準(zhǔn)，在相同色譜條件下進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析并根據(jù)下式進行化合物的計算，與文獻RI值進行比對。RI篩選標(biāo)準(zhǔn)為RIi±20，RIi為文獻參考值。

式中：t’r（X）為待測化合物X的調(diào)整保留時間；t’r（Cn）為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時間；t’r（Cn＋1） 為碳原子數(shù)為n＋1的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時間；n為碳原 子數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

SIMCA-P11.5（Umetrics，Sweden）用于PCA和PLSDA，IBM SPSS Statistics22用于HCA及比較香氣揮發(fā)物之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種栗香特征綠茶香氣成分分析和含量比較

表2 栗香綠茶中的揮發(fā)性化合物Table 2 Vlatile compounds in chestnut-like green tea samples

續(xù)表2

如表2所示，經(jīng)過峰的篩選，去除柱流失和含鹵族元素的化合物，樣品共鑒定出85 個揮發(fā)性組分，主要包括醇類、芳香烴、醛類、酮類、烷烴類、萜烯類、酯類。其中烷烴類（19 種）種類最多，酮類（14 種）、萜烯類（11 種）次之，芳香烴類（4 種）最少。通過與文獻進行對比，發(fā)現(xiàn)有12 種香氣物質(zhì)在栗香茶葉香氣研究中被檢測過[12-13]，包括3-蒈烯、芳樟醇、壬醛、水楊酸甲酯、2-甲基萘、茉莉酮、香葉基丙酮、（E）-β-紫羅蘭酮、δ-杜松烯、去二氫菖蒲烯、橙花叔醇、（Z）-己酸-3-己烯酯。在85 個共同化合物中，3 種香型茶樣相對含量較高的化合物（相對平均含量≥0.5%）主要有2,2,4,4-四甲基辛烷、（E）-3-丁酸己烯酯、2,3-二氫-2,2,6-三甲基苯甲醛、十二烷、癸醛、（Z）-正戊酸-3-己烯酯、1,2,3,4,4a,5-六氫-（1S,4S,-4aS）-1-異丙基-4,7-二甲基-萘、1,1,1-三甲基-1,2-二氫萘、（Z）-3-己酸己烯酯、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯、茉莉酮、十四烷、 （E）-β-紫羅蘭酮、2,4,6-三（1,1-二甲基乙基）-4-甲基環(huán)己-2,5-二烯-1-酮、去氫白菖烯、δ-杜松烯，這些成分對構(gòu)成綠茶的特征風(fēng)味有著重要的“基質(zhì)”作用，是香氣特征主體成分[13-14]。

已有研究中，栗香通常認(rèn)為與熱物理化學(xué)反應(yīng)生成的吡嗪、吡咯類等焦糖香物質(zhì)關(guān)聯(lián)性大[3,15-16]。本實驗檢測出6 種吡咯、吡嗪類物質(zhì)，分別是2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基-吡嗪、2-乙基-6-甲基-吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪、3-甲?；?4,5-二甲基吡咯、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪，體現(xiàn)所選茶樣的烘炒香風(fēng)味。

圖1 不同栗香綠茶化合物相對含量對比Fig. 1 Comparison of the relative content of each class of volatile components in different chestnut-like green tea samples

如圖1所示，嫩栗香型綠茶萜烯類物質(zhì)（14.52%）和醛類物質(zhì)（5.56%）相對含量高于板栗香型綠茶，板栗香型綠茶醇類、芳香烴、酮類、烷烴類、酯類物質(zhì)相對含量均高于嫩栗香型綠茶，而熟栗香型綠茶酯類物質(zhì)相對含量達(dá)到59.54%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其余2 種香型，熟栗香在其余類物質(zhì)含量均低于另外2 種香型。

（Z）-己酸-3-己烯酯和（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯2 種酯類物質(zhì)，在熟栗香中相對含量分別達(dá)到22.50%和17.83%，遠(yuǎn)大于嫩栗香和板栗香中含量，從表2可以看出，2 種物質(zhì)在3 種香型中差異顯著。（Z）-己酸-3-己烯酯是綠茶常見的揮發(fā)性組分，呈現(xiàn)強烈彌散性梨香，對西湖龍井茶香氣的形成有顯著貢獻[11]；（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯是一種食品用香料，具有強烈的透發(fā)青香，帶有生梨果香的莖樣氣息。炒青茶殺青時間長，苯甲醇、香葉醇等高沸點成分及吡嗪、吡咯等焦糖香物質(zhì)含量較高，通常具有栗香或清新的香氣[16]，與此同時，高溫作用使低沸點的物質(zhì)進一步揮發(fā)，發(fā)生酯化反應(yīng)，青葉醇與（Z）-3-己烯酸形成（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯，以芬芳的水果香參與形成茶香[17]。

2.2 多元統(tǒng)計分析

2.2.1 基于PCA對不同栗香特征綠茶的區(qū)分

圖2 PCA得分圖（A）和Hotelling T2分布圖（B）Fig. 2 PCA score plot (A) and Hotelling T2 value range plot (B)

近年來，隨著香氣檢測技術(shù)的發(fā)展和多元統(tǒng)計分析技術(shù)的普及，越來越多的統(tǒng)計分析方法應(yīng)用于茶葉香型的化學(xué)識別[18-19]，香氣指紋圖譜的建立[20]，香氣特征成分的研究[21]等方面。PCA是一種基于最大統(tǒng)計學(xué)距離投影的降維方法，使用少量的綜合變量（主成分）來取代原先的復(fù)雜多變量從而能在最大程度保留數(shù)據(jù)原有信息的情況下，降低數(shù)據(jù)復(fù)雜度，并對數(shù)據(jù)進行可視化處理[22]。

利用全部栗香茶樣香氣組分的相對含量進行PCA，提取得到4個主成分，累計貢獻率為61.4%，基本可以表征所涉及的化學(xué)成分信息。如圖2A所示，3種不同栗香特征的綠茶樣品具有明顯的區(qū)域分布特征。由于PCA屬于無監(jiān)督分析模式，沒有考慮樣本類別信息，對嫩栗香和板栗香2 種比較近似的香型區(qū)分不太明顯，但是18個樣品在99% Hotelling T2置信區(qū)間內(nèi)，沒有發(fā)現(xiàn)“離群樣本點”，如圖2B所示，且有16個樣品在95% Hotelling T2置信區(qū)間內(nèi)，表現(xiàn)出明顯的聚類趨勢。

2.2.2 基于PLS-DA對不同栗香特征綠茶的區(qū)分

和PCA相似，PLS-DA也是基于降維的多維向量分析方法，但是可以預(yù)設(shè)分類，其優(yōu)勢是可以盡量去除未控制變量對數(shù)據(jù)分析的影響，進一步挖掘數(shù)據(jù)中的信息，同時可以量化特征化合物造成組分差異的程度[23-25]。

以鑒定的85 個揮發(fā)性組分含量為X變量（表2），以18 個綠茶樣栗香特征為Y變量進行PLS-DA。由圖3A可以看出，18 個栗香茶樣根據(jù)其香氣特征被明顯區(qū)分， R2Y＝0.843，Q2＝0.694，說明該模型對3 種栗香特征綠茶具有良好的穩(wěn)定性和較好的預(yù)測能力。將模型建立時定義的分類Y矩陣的變量隨機排列200 次，得到隨機的不同相應(yīng)Q2值作為衡量模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。如圖3B所示，R2＝0.424，Q2＝－0.318，Q2負(fù)值表明該PLS-DA模型可靠，未存在過擬合現(xiàn)象，可以用于各自類別的判別分析。

圖3 PLS-DA得分圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig. 3 Score plot of PLS-DA (A) and plot of permutation test (B)

2.2.3 重要香氣組分分析

圖4 PLS-DA因子載荷圖（A）和VIP得分圖（B）Fig. 4 Loading plot of PLS-DA (A) and VIP scores (B)

因子載荷圖可以反映每一個變量在得分圖上的貢獻，分布越密集的變量對栗香分類的影響越小，反之，離密集區(qū)越遠(yuǎn)的變量對栗香分類的影響越大。從圖4A可以看出，茉莉酮（No.70）、香葉醇（No.55）、3,6-二甲基-辛烷（No.56）、香葉基丙酮（No.74）、2-甲基萘（No.58）可作為嫩栗香型的特征揮發(fā)性組分；板栗香型與辛醛（No.10）、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛（No.41）、（E）-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯（No.32）和3-甲基-十一烷（No.39）的含量顯著相關(guān)，可作為板栗香型的特征揮發(fā)性組分；2,6,10-三甲基-十二烷（No.66）、1-癸醇（No.44）、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯（No.68）、（Z）-正戊酸-3-己烯酯（No.52）、（E）-3-丁酸己烯酯（No.42）和2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪（No.60）與熟栗香型綠茶距離更近，對熟栗香型有更好的辨別能力，可作為熟栗香型的特征組分。

變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）可以量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻，通常認(rèn)為VIP大于1.0表示在判別過程中具有重要作用。VIP值越大，變量在栗香綠茶不同香型間的差異越顯著。由圖4B可以看出，有38 個揮發(fā)物VIP大于1.0可作為區(qū)分3 種不同栗香特征綠茶的標(biāo)志物，特別是癸烷（No.9）、2,2,4,6,6-五甲基-庚烷（No.4）、去二氫菖蒲烯（No.81）、茉莉酮（No.70）、δ-杜松烯（No.80）、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛（No.41）、（Z）-3-己酸己烯酯（No.67），其VIP大于1.4，在區(qū)分3 種不同栗香特征的綠茶時尤為重要。

2.2.4 基于HCA對不同栗香特征綠茶的區(qū)分

圖5 不同風(fēng)味栗香茶的聚類分析樹狀圖Fig. 5 Dendrogram for chestnut-like green tea constructed using Ward’s linkage

如圖5所示，3種栗香香型綠茶可以在聚類距離12處被清晰地分成3 個聚類，其中Cluster I為熟栗香的香型聚類，Cluster II、Cluster III分別為嫩栗香和板栗香的聚類。此外，嫩栗香和板栗香在約14的距離可以聚合成一個聚類，說明在3 種香型中嫩栗香和板栗香在香型距離中更近，相似度更高，這與審評小組在審評過程中的感官印象一致：嫩栗香和板栗香更像一種水煮板栗的香氣特征，而熟栗香更接近高火香的茶香。在專業(yè)審評書籍上將板栗香和嫩栗香視為同一種香氣，由此可見，聚類效果和感官辨識基本一致[4]。

3 討 論

本實驗用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合多元統(tǒng)計分析技術(shù)實現(xiàn)對3 種不同栗香特征綠茶的有效識別。通過PCA提取4 個主成分，累計方差貢獻率為61.4%，基本可以表征所涉及的化學(xué)成分信息。結(jié)果表明，3種不同栗香特征的綠茶樣品具有明顯的區(qū)域分布特征。PLS-DA中，18個栗香茶樣根據(jù)其香氣特征實現(xiàn)良好分離，R2Y＝0.843，Q2＝0.694，說明該模型對3 種栗香特征綠茶具有良好的穩(wěn)定性和較好的預(yù)測能力；通過置換檢驗發(fā)現(xiàn)，R2＝0.424，Q2＝－0.318，表明該模型可靠。通過HCA，3種栗香香型綠茶可以在聚類距離12處被清晰地分成3 個聚類，其中板栗香型和嫩栗香型距離更接近，和人工感官結(jié)果相似。

茉莉酮、香葉醇、3,6-二甲基-辛烷、香葉基丙酮、2-甲基萘、對嫩栗香型有更好的辨別能力，可作為嫩栗香型的特征性組分；在以往研究中，茉莉酮、香葉醇、香葉基丙酮、（Z）-3-己酸己烯酯已經(jīng)被多次論證為龍井茶特征風(fēng)味物質(zhì)[28]。茉莉酮呈茉莉花香，香葉基丙酮呈現(xiàn)果香、清香[14]，香葉醇具有薔薇系溫和的花香，香葉醇是綠茶中典型的風(fēng)味物質(zhì)，其含量與茶樹的品種、加工方法、鮮葉老嫩有關(guān)[29]。

辛醛、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛、（E）-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯和3-甲基-十一烷可作為板栗香型的特征性組分；辛醛在朱蔭等[13]研究中也有出現(xiàn)，有研究證明，脂肪醛大多呈現(xiàn)濃烈的果香風(fēng)味，還帶些許面包氣。

熟栗香型與2,6,10-三甲基-十二烷、1-癸醇、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯、（Z）-正戊酸-3-己烯酯、（Z）-3-己酸己烯酯、（E）-3-丁酸己烯酯和2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪含量顯著相關(guān)，可作為熟栗香型的特征性組分。酯類化合物大多呈現(xiàn)輕微果香，（Z）-己酸-3-己烯酯則呈現(xiàn)強烈的彌散性梨香，對西湖龍井的香氣特征形成具有顯著作用。萜烯類化合物是茶葉香氣的重要組成部分，單萜及倍半萜大都帶有濃郁的甜香、花香和木香，是各類茶的主要香氣成分[30]。

綜上可知，茉莉酮、香葉醇、香葉基丙酮、2-甲基萘可作為嫩栗香型的特征性組分，辛醛、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛、（E）-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯可作為板栗香型的特征性組分，1-癸醇、（Z,Z）-3-己烯酸-3-己烯酯、（Z）-正戊酸-3-己烯酯、（Z）-3-己酸己烯酯、（E）-3-丁酸己烯酯和2-（3-甲基丁基）-3,5-二甲基吡嗪可作為熟栗香型的特征性組分。

根據(jù)VIP大于1.0篩選出38 種對不同栗香綠茶進行有效區(qū)分的標(biāo)志物，特別是癸烷、2,2,4,6,6-五甲基-庚烷、去二氫菖蒲烯、茉莉酮、δ-杜松烯、（E）-9-甲基-2-十一碳烯醛、（Z）-3-己酸己烯酯，其VIP大于1.4，而且這7 種物質(zhì)存在顯著差異（P＜0.05），因此這7 種物質(zhì)在區(qū)分3 種不同栗香特征的綠茶過程中發(fā)揮著重要作用。

此外，大多數(shù)高含量的組分（相對平均含量≥0.5%）多集中于揮發(fā)性物質(zhì)譜圖的中后部，證明栗香香型綠茶揮發(fā)性物質(zhì)大多為中高沸點的化合物，這與葉國柱等[31]的研究推斷一致，在16 種相對高含量的共同化合物中，有4 種酯類、4 種烯類、3 種酮類、2 種醛類和3 種烷烴類，其中酯類物質(zhì)的含量顯著大于其他幾類物質(zhì)，相對含量達(dá)到31.26%，可推測，炒干過程中高溫作用使低沸點的物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，形成的大分子質(zhì)量酯類，以及在加熱水解條件下萜苷類發(fā)生環(huán)化、脫水、異構(gòu)化釋放的烯醇、烯醛、萜烯構(gòu)成了栗香綠茶風(fēng)味特征的主體物質(zhì)。