張哲奇，臧明伍*，張凱華，李 丹，王守偉，李笑曼，薛丹丹

（北京食品科學(xué)研究院，中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

粉蒸肉是我國(guó)一道著名的傳統(tǒng)菜肴，具有較為獨(dú)特的風(fēng)味，但是有關(guān)其獨(dú)特風(fēng)味的形成機(jī)制，尤其是不同加工步驟對(duì)產(chǎn)品最終風(fēng)味的呈現(xiàn)缺乏相關(guān)研究。目前單獨(dú)對(duì)肉制品風(fēng)味形成機(jī)制的探索較為深入[1-4]；稻米、米粉特有風(fēng)味的研究也日趨豐富；淀粉顆粒對(duì)其本身風(fēng)味物質(zhì)的吸附和釋放也有相關(guān)研究[5-6]，但尚鮮見肉類與淀粉類物質(zhì)交互作用的相關(guān)文獻(xiàn)，無法較為明確地闡明粉蒸肉產(chǎn)品特征風(fēng)味的形成機(jī)制以及關(guān)鍵影響因素。所以本研究從粉蒸肉的幾個(gè)關(guān)鍵加工步驟入手，分析不同加工步驟對(duì)最終風(fēng)味呈現(xiàn)的作用以確定其風(fēng)味形成的機(jī)理機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步深入研究提供基礎(chǔ)。

動(dòng)態(tài)頂空樣品（dynamic headspace sampling，DHS）制備法基于動(dòng)態(tài)頂空原理，與固相微萃取相比，能夠更好地富集樣品中痕量揮發(fā)性物質(zhì)，從而更加完整、真實(shí)地反映樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的構(gòu)成[7]。氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法是食品檢測(cè)領(lǐng)域常用方法，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘、獸殘、風(fēng)味物質(zhì)等痕量物質(zhì)含量的測(cè)定。由于人的嗅覺器官極為靈敏，甚至能夠分辨出低于質(zhì)譜檢出限的氣味[8]，故采用嗅聞儀作為產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)的輔助鑒定手段。

氣味活性值（odor activity value，OAV）是以揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量分析為基礎(chǔ)，參考各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在水中的風(fēng)味閾值，計(jì)算得到的可以表征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)大小的指標(biāo)，該值越大，對(duì)應(yīng)組分對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大[9]。主成分分析（principal component analysis，PCA）能夠?qū)⒍鄠€(gè)指標(biāo)簡(jiǎn)化為幾個(gè)綜合指標(biāo)，在充分利用大部分原始變量信息的基礎(chǔ)上簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)并揭示變量相互之間的關(guān)系[10]，是一種常見的風(fēng)味分析方法。本實(shí)驗(yàn)采用DHS-GC-MS-嗅聞法對(duì)粉蒸肉各關(guān)鍵加工工藝階段風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行定性及定量分析，結(jié)合OAV和PCA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，探究關(guān)鍵加工步驟對(duì)于粉蒸肉最終風(fēng)味形成的影響，以期為產(chǎn)品最終風(fēng)味的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米、香米、蔥、姜、蒜等 市售；冷鮮五花肉 千喜鶴股份有限公司；粉蒸肉加工用香辛料、調(diào)味料 中國(guó)肉類食品綜合研究中心香辛料部；2-甲基-3-庚酮、C5～C20正構(gòu)烷烴 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDS半自動(dòng)熱脫附進(jìn)樣器、Tenax TA石英玻璃吸附管、TC-20型Tenax-TA吸附管自動(dòng)凈化儀 德國(guó)Gerstel公司；動(dòng)態(tài)頂空瓶 自制；ODP2嗅聞檢測(cè)儀 瑞士Brechbühler公司；TSQ8000 GC-MS聯(lián)用儀、TG-Wax MS極性柱 美國(guó)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蒸肉米粉和腌料的制作

米粉采用100 g糯米和100 g稻米混合均勻后上鍋炒至金黃且有米香，待冷卻后用粉碎機(jī)打成米粉（粒徑約1 mm），與1 g花椒粉、1 g大料粉、2 g桂皮粉、2 g辣椒粉、2 g五香粉、2 g姜粉混合均勻備用。

腌料采用10 g蠔油、7 g生抽、3 g老抽、10 g腐乳汁、4 g甜面醬、15 g料酒、8 g糖、4 g鹽混合配制而成。

1.3.2 樣品的制備與取樣

腌制組：五花肉洗凈→去皮→切片→腌制→成品；鮮肉加熱組：五花肉洗凈→去皮→切片→大火蒸制→冷卻→成品；腌制加熱組：五花肉洗凈→去皮→切片→腌制→大火蒸制→冷卻→成品；粉蒸肉組：五花肉洗凈→去皮→切片→腌制→上粉→大火蒸制→冷卻→成品[11-12]。

操作要點(diǎn)：肉片厚度約4～6 mm，肉片長(zhǎng)寬分別以不大于50 mm和30 mm為宜，腌制時(shí)間40 min，腌料用量為肉質(zhì)量的1/5，上粉米粉用量為肉質(zhì)量的1/3，蒸制時(shí)間60 min。

從各備用樣品中取樣，每次取樣量約為100 g。樣品采用鋁箔袋真空包裝，于－18 ℃冷凍備用。

1.3.3 粉蒸肉樣品的DHS前處理與GC-MS-嗅聞分析

將各階段肉樣于室溫下切碎混勻后準(zhǔn)確取10.00 g裝入動(dòng)態(tài)頂空瓶中，旋緊瓶蓋，加入1 μL 1.632 μg/μL的2-甲基-3庚酮作為內(nèi)標(biāo)物，動(dòng)態(tài)頂空瓶的一端通氮?dú)?，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，另一端接老化至無色譜雜峰的TA吸附管，在55 ℃恒溫條件下富集30 min，之后取出吸附管并插入半自動(dòng)熱脫附進(jìn)樣器進(jìn)樣口進(jìn)樣。

半自動(dòng)熱脫附進(jìn)樣條件：采用標(biāo)準(zhǔn)加熱模式；氦氣流速20 mL/min；不分流；初始溫度40 ℃，延遲0.1 min，保持0.1 min，然后以40 ℃/min上升至210 ℃，保持5 min；傳輸線溫度215 ℃。

冷進(jìn)樣條件：采用標(biāo)準(zhǔn)加熱模式；液氮冷卻，初始溫度－100 ℃，平衡0.1 min，之后以10 ℃/min升至215 ℃，保持5 min；分流比20∶1。

GC條件：TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.99%）；流速1.0 mL/min；采用不分流模式，保持2 min。升溫程序：進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱溫起始溫度40 ℃，保持3 min，之后以5 ℃/min速率升溫至200 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持3 min。

MS條件：傳輸線溫度230 ℃，電子能量70 eV，電子電離源，離子源溫度280 ℃，質(zhì)量掃描范圍40～600 u；全掃描模式。

嗅聞儀接口溫度200 ℃。檢測(cè)時(shí)為防止評(píng)價(jià)員鼻腔干燥，通入濕潤(rùn)氮?dú)?。用預(yù)處理后的樣品及標(biāo)準(zhǔn)香氣化合物對(duì)每位評(píng)價(jià)員反復(fù)培訓(xùn)后再進(jìn)行樣品實(shí)驗(yàn)，由3 位評(píng)價(jià)員在嗅覺檢測(cè)口處記錄聞到香氣的時(shí)間以輔助揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性鑒定，每種化合物的香氣描述及時(shí)間至少由其中2 名評(píng)價(jià)員評(píng)價(jià)一致才確定。

1.3.4 風(fēng)味化合物定性與定量分析

1.3.4.1 定性分析

譜庫(kù)檢索鑒定：采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）和Willey譜庫(kù)檢索，選取正反匹配度均大于800的化合物進(jìn)行定性鑒定。

保留指數(shù)（retention index，RI）：計(jì)算各揮發(fā)物的RI并與文獻(xiàn)中的RI進(jìn)行比對(duì)，并按式（1）計(jì)算：

式中：Rtx、Rtn及Rtn＋1分別為待測(cè)揮發(fā)性成分、含n個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴及（n＋1）個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min。

1.3.4.2 定量分析

根據(jù)已知內(nèi)標(biāo)2-甲基-3庚酮的含量對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行定量分析，按公式（2）計(jì)算每一種風(fēng)味化合物相對(duì)于內(nèi)標(biāo)化合物的含量：

式中：CX為未知揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；CO為內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)量濃度/（μg/μL）；VO為內(nèi)標(biāo)化合物進(jìn)樣體積/μL；SX為未知揮發(fā)性化合物的峰面積/（AU·min）；SO為添加的內(nèi)標(biāo)化合物峰面積/（AU·min）；m為試樣質(zhì)量/kg。

1.3.5 風(fēng)味成分評(píng)價(jià)

采用OAV評(píng)價(jià)各化合物對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)； 0.1＜OAV＜1，說明該物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味有修飾作用；OAV＞1，說明該物質(zhì)可能對(duì)總體風(fēng)味有直接影響；在一定范圍內(nèi)，OAV越大說明該物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大[13]。按式（3）計(jì)算：

式中：C為物質(zhì)含量/（μg/kg）；T為感覺閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用UnscrambX10.1進(jìn)行PCA；其他數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組揮發(fā)性物質(zhì)與含量分析

由表1、2可知，4 個(gè)處理組中共鑒定出79 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烴類最多，為23 種，其次是酯類19 種，醛類14 種，醇類12 種，酸類2 種，雜環(huán)化合物3 種，酮類3 種，酚類1 種，其他類2 種。其中共有揮發(fā)性物質(zhì)28 種。不同處理組中揮發(fā)性物質(zhì)的構(gòu)成存在差異，揮發(fā)性物質(zhì)種類分別為69、51、54、51 種，總含量分別為2 044.35、2 706.15、2 869.76、2 900.12 μg/kg。腌制處理樣品具有最多的揮發(fā)性物質(zhì)種類，但是揮發(fā)性物質(zhì)含量最低；揮發(fā)性物質(zhì)總含量最高的是粉蒸肉組，但與其他3 組差異不顯著（P＞0.05）；鮮肉加熱組中醛類物質(zhì)含量最高，腌制加熱組則具有最高的酯類和醇類物質(zhì)含量。

表1 各組風(fēng)味物質(zhì)含量Table 1 Identification and quantification of volatile compounds in four groups

續(xù)表1

表2 各組中風(fēng)味物質(zhì)種類及含量Table 2 Classes of volatile compounds and their contents in four groups

2.1.1 烴類物質(zhì)

烴類物質(zhì)在各組樣品中均具有較高的含量，在檢測(cè)到的23 種烴類物質(zhì)中，飽和烴類占13 種，且4 組之間差異不大。雖然飽和烴類物質(zhì)由于普遍具有較高的嗅覺閾值而對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，但是其主要生成途徑與部分醛類相同，均來源于脂肪酸烷氧基的均裂[14]，且是雜環(huán)物質(zhì)的中間體[15]，所以其含量變化對(duì)最終風(fēng)味的呈現(xiàn)具有一定的相關(guān)性。鮮肉加熱組的芳香族化合物和烯烴類化合物與其他組存在較大差異，但腌制未加熱組和腌制加熱組這兩類物質(zhì)含量差異不大，提示這兩類物質(zhì)可能來源于腌料中，且受溫度影響不大。粉蒸肉組正構(gòu)烷烴含量較低而芳香族化合物和烯烴類物質(zhì)含量較高，可能是由于部分正構(gòu)烷烴是芳香族化合物和烯烴類物質(zhì)的前體物，此外芳香族化合物和烯烴類物質(zhì)也可能是來源于米粉中[16]。

2.1.2 醛類物質(zhì)

醛類物質(zhì)具有較低的嗅覺閾值，通常認(rèn)為其在肉制品風(fēng)味的呈現(xiàn)中起到較大的作用。粉蒸肉加熱過程中醛類物質(zhì)共檢出14 種，己醛、庚醛、壬醛、癸醛主要來自油酸、亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸的氧化，具有清香、果香、花香、脂肪香氣，對(duì)于粉蒸肉樣品風(fēng)味的形成具有較大貢獻(xiàn)[17-19]。4 組樣品鮮肉加熱組-粉蒸肉組-腌制加熱組-腌制組醛類物質(zhì)含量比為8.88∶3.34∶1.41∶1，可以看出鮮肉加熱組醛類物質(zhì)的含量，尤其是己醛含量遠(yuǎn)高于其他3 組，而腌制組含量最低。這是由于醛類物質(zhì)主要來源于脂肪酸的受熱降解、氧化，腌制加熱組和粉蒸肉組醛類物質(zhì)低于鮮肉組可能主要是由于醛類物質(zhì)與香辛料中的醇類、酯類物質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)，并且香辛料中的一些成分具有抗氧化作用，可能導(dǎo)致脂肪酸氧化反應(yīng)阻斷。此外，米粉中醛類物質(zhì)含量較為豐富，這可能是粉蒸肉組醛類物質(zhì)含量高于腌制加熱組的原因[20-21]。

2.1.3 酯類物質(zhì)

4 組樣品中腌制加熱組中酯類物質(zhì)含量最高，而粉蒸肉組含量最低，其他2 組含量較為接近。腌制樣品中酯類物質(zhì)可能主要來源于腌制料，如料酒、醬油、腐乳、甜面醬中都具有較為豐富的酯類物質(zhì)，所以其中的酯類物質(zhì)種類最為豐富[22-23]。酯類物質(zhì)的另一個(gè)重要來源是加熱過程中豬肉脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的醇與游離脂肪酸的相互作用，這也可以很好地解釋鮮肉加熱組中酯類物質(zhì)的來源。而腌制加熱組除具有上述2 種酯類物質(zhì)來源外，腌料中豐富的醇類與肉中游離脂肪酸以及醛類氧化形成的酸進(jìn)行的酯化反應(yīng)也是其重要來源，這也是該組具有最高酯類物質(zhì)含量的原因[24]。粉蒸肉組酯類物質(zhì)含量最低，推測(cè)是米粉的加入影響了酯類物質(zhì)的生成，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的酯類物質(zhì)為辛酸乙酯、丁酸乙酯。辛酸乙酯具有白蘭地酒香，丁酸乙酯具有香蕉、菠蘿香，在不同階段樣品中含量變化不大，可能主要是來源于料酒或腐乳汁。

2.1.4 醇類物質(zhì)

4 組樣品中鮮肉加熱組1-辛烯-3-醇含量最高，1-辛烯-3-醇主要來源于脂肪氧化[25]，在低濃度下具有蘑菇香、泥土香氣，但濃度較高時(shí)氣味不佳，這也能部分解釋鮮肉直接加熱后風(fēng)味不佳的原因。腌制加熱組醇類物質(zhì)總含量最高，主要是其乙醇和苯乙醇含量遠(yuǎn)高于其他組，苯乙醇有可能是苯乙烯與水發(fā)生反應(yīng)生成，乙醇則可能是由于加熱導(dǎo)致乙醇揮發(fā)加劇所致。粉蒸肉中含量較高的主要是2-乙基己醇，作為一種常用的增香劑對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)，可能來源于醛類物質(zhì)加氫產(chǎn)生。

2.1.5 酸類、雜環(huán)類、酮類、酚類及其他物質(zhì)

酸類、雜環(huán)類、酮類、酚類等物質(zhì)在4 組樣品中均有檢出，但種類較少、含量偏低，且大部分對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。酸類物質(zhì)在鮮肉加熱組中未檢出，提示脂肪水解氧化可能并非是酸類物質(zhì)的主要來源。桉葉油醇具有樟腦樣香氣和清涼味道，主要來源于香辛料，但鮮肉加熱組樣品中也有檢出，且含量與腌制組及腌制加熱組不具有顯著性差異，提示豬肉中也可能存在其生成途徑。苯酚在較低濃度下具有甜香氣味，有研究顯示在生肉中存在此類物質(zhì)[26]。

2.2 氣體活性物質(zhì)分析

由表3可以看出，腌制組對(duì)總體氣味貢獻(xiàn)較大（OAV＞30）的主要為壬醛、癸醛、（Z）-癸-2-烯醛、反式-2,4-癸二烯醛，可能主要是肉本身香氣以及香辛料中自然揮發(fā)出的風(fēng)味物質(zhì)。鮮肉加熱組主要為正己醛、壬醛、（Z）-癸-2-烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇對(duì)風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)較大，且均為肉品中常見的風(fēng)味物質(zhì)，但除壬醛外其他3 種物質(zhì)OAV均為4 組中最高，而較高濃度下很多風(fēng)味物質(zhì)都呈現(xiàn)不良?xì)馕?，所以這3 種物質(zhì)含量過多可能是鮮肉加熱后風(fēng)味不佳的原因。腌制加熱組貢獻(xiàn)較大的風(fēng)味物質(zhì)主要是壬醛、癸醛、反式-2,4-癸二烯醛、苯酚，主要是由于加熱過程中原輔料之間相互作用風(fēng)味物質(zhì)受熱后揮發(fā)加劇。粉蒸肉組則主要是壬醛、癸醛和桉葉油醇貢獻(xiàn)較大，與其他組相比，粉蒸肉組OAV總體相對(duì)較低，這可能是由于淀粉對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的形成具有一定的阻礙并對(duì)其釋放產(chǎn)生抑制作用，但所有可能對(duì)粉蒸肉風(fēng)味產(chǎn)生影響的物質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)其他文獻(xiàn)中描述的典型米香風(fēng)味物質(zhì)，有待進(jìn)一步深入研究[27-34]。

表3 不同加熱時(shí)間粉蒸肉風(fēng)味物質(zhì)OAVTable 3 OAV values of volatile compounds in four groups

2.3 PCA結(jié)果

由圖1可知，PC1貢獻(xiàn)率為85%，PC2貢獻(xiàn)率為13%，總貢獻(xiàn)率為98%，表明PC1、PC2能夠基本反映樣品特征。不同加熱時(shí)間樣品在PC1和PC2構(gòu)建的平面上區(qū)分度較好。4 組樣品分布在第1、4象限，其中鮮肉加熱處理樣品和腌制后加熱處理樣品在PC1上差距不大，但在PC2上存在一定差距；腌制和腌制加熱處理樣品在PC2上差距不明顯，但在PC1上差異較大；粉蒸肉組在PC1上貢獻(xiàn)率較低，但在PC2上貢獻(xiàn)率較大。結(jié)果顯示，添加米粉對(duì)粉蒸肉風(fēng)味的影響較為明顯。

圖1 主成分載荷圖Fig. 1 PCA loading plot of PC2 against PC1

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用DHS-GC-MS-嗅聞聯(lián)用法對(duì)鮮肉腌制、鮮肉加熱、腌制加熱、粉蒸肉4 組樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行分析。共鑒定出了79 種揮發(fā)性物質(zhì)。包括烴類物質(zhì)23 種、酯類物質(zhì)19 種、醛類物質(zhì)14 種、醇類12 種、雜環(huán)化合物3 種、酮類3 種、酸類物質(zhì)2 種、酚類1 種、其他類2 種，其中共有物質(zhì)28 種。采用OAV對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)進(jìn)行分析顯示，對(duì)風(fēng)味有貢獻(xiàn)的物質(zhì) （OAV＞0.1）共28 種。4 組樣品中鮮肉加熱組總OAV最高，主要是由于加熱處理導(dǎo)致己醛、1-辛烯-3-醇、反式-2,4-癸二烯醛的大量產(chǎn)生，而高濃度下這些物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不良?xì)馕?；粉蒸肉組OAV最低，主要是由于其檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)中含有較多不呈味的烴類物質(zhì)，對(duì)其風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的主要是癸醛、壬醛和桉葉油醇?？傮w來看，加入腌制料能夠較為明顯降低豬肉中風(fēng)味物質(zhì)尤其是醛類物質(zhì)的過度生成，進(jìn)而改善豬肉加熱后的風(fēng)味，添加米粉后則主要進(jìn)一步降低了產(chǎn)品的油脂類香氣、肉香，提高香辛料類香氣的貢獻(xiàn)。PCA顯示粉蒸肉組在PC1和PC2上與其他3 組區(qū)分度明顯，且PC1上尤為顯著，提示米粉的加入對(duì)風(fēng)味的改變較為明顯。本實(shí)驗(yàn)并未檢出典型米香氣味如2-乙?；量┻龋f明米粉對(duì)于風(fēng)味的改變可能更多源于對(duì)肉類風(fēng)味物質(zhì)生成和釋放的影響，其本身風(fēng)味影響較小。