■余璐璐 宋全芳 嚴(yán) 峰 張廣民 孟慶剛 黃雪石

(1.天津挑戰(zhàn)博德生物技術(shù)有限公司，天津 301900；2.天津博菲德生物科技有限公司，天津 301900；3.阜新蒙古族自治縣阜新鎮(zhèn)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧阜新 123100；4.阜新蒙古族自治縣獸藥飼料畜產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)所，遼寧阜新 123100)

近年來由于畜禽養(yǎng)殖中抗生素的濫用，造成畜禽體內(nèi)藥物殘留、腸道微生態(tài)的破壞，畜禽免疫力的降低等，特別是畜禽產(chǎn)品中的藥物殘留問題，對(duì)人體健康產(chǎn)生巨大威脅，而純生物制劑產(chǎn)品——酶制劑作為抗生素的替代產(chǎn)品，已經(jīng)成為當(dāng)今飼料工業(yè)中應(yīng)用較為廣泛的一類產(chǎn)品。

β-甘露聚糖酶是一種以內(nèi)切方式降解甘露聚糖的水解酶，屬于半纖維素酶類。畜禽動(dòng)物體內(nèi)不含消化甘露聚糖的消化酶系，在飼料中添加β-甘露聚糖酶能夠降解植物性飼料原料中的抗?fàn)I養(yǎng)成分，促進(jìn)畜禽生長性能的提升[1]，而且其產(chǎn)生的甘露寡糖（MOS）可以調(diào)節(jié)畜禽腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，促進(jìn)腸道健康[2]。當(dāng)前對(duì)β-甘露聚糖酶的應(yīng)用開發(fā)主要有動(dòng)物試驗(yàn)和體外消化試驗(yàn)（胃蛋白酶-胰酶兩步法），因體外消化試驗(yàn)時(shí)間周期短，效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)因此普遍應(yīng)用在產(chǎn)品的前期篩選中。本研究旨在通過體外仿生消化法對(duì)酸性及中性β-甘露聚糖酶的不同活力組合進(jìn)行篩選開發(fā)出復(fù)合型β-甘露聚糖酶，并驗(yàn)證其對(duì)斷奶仔豬生長性能及血清生化指標(biāo)的影響，為β-甘露聚糖酶在斷奶仔豬上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸性和中性β-甘露聚糖酶及酶活力檢測(cè)方法均由天津挑戰(zhàn)博德生物技術(shù)有限公司提供；單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)（SDS-Ⅲ），湖南中本智能科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

體外仿生消化試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共分為6個(gè)組別（酸性、中性β-甘露聚糖酶的總添加活性4 U/g），對(duì)照組為不加酶組，5個(gè)加酶組，酸性與中性β-甘露聚糖酶活力比例分別為0∶100、25∶75、50∶50、75∶25、100∶0，消化底物為試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧，每個(gè)組別5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1根消化管。消化結(jié)束后以DNS法檢測(cè)消化液中還原糖釋放量。胃緩沖液、小腸緩沖液及體外仿生消化法操作過程參照《一種飼料可消化碳水化合物總量的仿生消化測(cè)定方法》[3]進(jìn)行配制及操作。

動(dòng)物試驗(yàn)于挑戰(zhàn)集團(tuán)安慶豬場(chǎng)進(jìn)行，選取剛斷奶的杜長大三元雜交健康仔豬300頭（體重?zé)o顯著差異，斷奶日齡相差不超過3 d），公母混合，隨即分到4個(gè)處理中，添加復(fù)合型β-甘露聚糖酶活力分別為0、2 000、4 000、6 000 U/kg，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭豬，試驗(yàn)開始前進(jìn)行7 d預(yù)飼，正式試驗(yàn)時(shí)間為28 d。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧參照 NRC（1998）營養(yǎng)需求推薦及飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理及測(cè)定指標(biāo)

按照試驗(yàn)豬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理規(guī)程及免疫程序進(jìn)行飼養(yǎng)，分別于試驗(yàn)第1 d和28 d清晨進(jìn)行空腹稱重，以重復(fù)為單位，記錄每日的耗料量；自由采食和飲水，每天觀察記錄仔豬的腹瀉狀況，通過記錄試驗(yàn)期間飼料消耗及體重計(jì)算出仔豬的平均日增重、平均日采食量和料重比。

分別于試驗(yàn)第1 d和28 d稱重后，每欄隨機(jī)挑選公母豬各1頭，前腔靜脈采血（不加抗凝劑），4 000 r/min離心10 min分離血清，-20℃保存待測(cè)。根據(jù)試劑盒（羅氏公司提供）說明，用羅氏cobas?c 311全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中血糖（GLU）、尿素氮（UN）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合型β-甘露聚糖酶不同比例組合對(duì)還原糖釋放量的影響（見表2）

表2 復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)還原糖釋放量的影響

由表2結(jié)果可知，添加β-甘露聚糖酶能顯著促進(jìn)仔豬日糧的還原糖釋放量，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸性與中性β-甘露聚糖酶的不同比例組合對(duì)還原糖釋放量的效果均高于單酶添加效果，說明二者之間存在協(xié)同增效效應(yīng)；酸性與中性β-甘露聚糖酶 0∶100、25∶75、50∶50、75∶25、100∶0的比例添加與不加酶組相比提高量分別為3.36%、5.30%、7.64%、6.79%、4.78%，結(jié)果表明，酸性與中性β-甘露聚糖酶活力比例為50∶50時(shí)，對(duì)還原糖釋放提高量最為明顯，所以在乳仔豬動(dòng)物試驗(yàn)酸性與中性β-甘露聚糖酶酶活添加比例以50∶50進(jìn)行。

2.2 復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響（見表3）

表3 復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

根據(jù)體外仿生消化試驗(yàn)結(jié)果，斷奶仔豬試驗(yàn)中酸性與中性β-甘露聚糖酶活力組成以50∶50進(jìn)行添加。由表3可知，添加一定量的復(fù)合型β-甘露聚糖酶能夠改善斷奶仔豬的生長性能，4 000 U/kg復(fù)合型β-甘露聚糖酶和6 000 U/kg復(fù)合型β-甘露聚糖酶與對(duì)照相比，能顯著提高斷奶仔豬末重、日均采食量、日增重（P＜0.05）；2 000 U/kg復(fù)合型β-甘露聚糖酶與對(duì)照相比，對(duì)斷奶仔豬末重、日均采食量、日增重均無明顯差異（P＞0.05）；β-甘露聚糖酶的不同添加水平對(duì)料重比均無明顯影響（P＞0.05）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，2 000、4 000、6 000 U/kg三種劑量添加均能顯著降低仔豬腹瀉（P＜0.05）。

2.3 復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響（見表4）

表4 復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)斷奶仔豬血清生化參數(shù)的影響

由表4可見，與對(duì)照組相比，在試驗(yàn)第28 d時(shí)日糧添加4 000、6 000 U/kg復(fù)合型β-甘露聚糖酶顯著增加了斷奶仔豬血清中GLU和TP含量（P＜0.05）；但添加不同劑量的復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)斷奶仔豬血清中ALB、UN、IgA和IgG含量無顯著差異（P＞0.05）。與添加2 000 U/kg復(fù)合型β-甘露聚糖酶相比，在試驗(yàn)第28 d時(shí)日糧添加4 000 U/kg和6 000 U/kg復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)斷奶仔豬血清中血糖有增加的趨勢(shì)，且有顯著性差異（P＜0.05）。其他各組間無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 復(fù)合型β-甘露聚糖酶體外作用效果評(píng)估

近年來飼料酶制劑的體外評(píng)估已取得一定的進(jìn)展，趙敏（2007）以“胃蛋白酶-胰液素”體外消化法評(píng)估NSP酶對(duì)畜禽日糧的作用效果，結(jié)果表明NSP酶對(duì)畜禽日糧代謝能具有明顯的遞增效應(yīng)[4]。何科林（2012）利用體外消化法篩選出NSP酶在玉米-豆粕和玉米-小麥日糧中最適添加量及酶譜，在動(dòng)物試驗(yàn)中取得了較為理想的效果[5]。廖睿（2016）研究表明利用仿生消化法測(cè)定飼糧還原糖釋放量的方法可以有效地評(píng)估NSP酶的效果[6]。本研究體外仿生消化試驗(yàn)結(jié)果(見表2)也顯示，添加β-甘露聚糖酶對(duì)日糧還原糖釋放量提高量達(dá)3.36%以上，這也表明了β-甘露聚糖酶能夠提高畜禽對(duì)日糧的利用效率。畜禽的消化生理?xiàng)l件要求飼用酶制劑要同時(shí)適應(yīng)胃液中較強(qiáng)的酸性環(huán)境和小腸的中性環(huán)境才能發(fā)揮較好的作用效果，而β-甘露聚糖酶的較多的發(fā)酵菌種和表達(dá)系統(tǒng)來源導(dǎo)致其不同的酶學(xué)性質(zhì)，包括最適pH值、等電點(diǎn)以及酶切位點(diǎn)等。歐陽海燕等（2017）發(fā)現(xiàn)不同菌種來源NSP酶的水解產(chǎn)物均有差異，且不同菌種來源NSP酶具有協(xié)同增效作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)日糧還原糖釋放量的作用效果均高于單酶效果，表明了酸性與中性β-甘露聚糖酶具有協(xié)同增效的效果，且以50∶50復(fù)合情況下對(duì)還原糖釋放提高量最為明顯，達(dá)到了7.64%。

3.2 甘露聚糖酶對(duì)乳仔豬生長性能及腹瀉率的影響

β-甘露聚糖酶降低甘露聚糖等的抗?fàn)I養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在破壞植物性飼料原料的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使其包裹的營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來；降低消化道內(nèi)的食糜黏度，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)一步消化吸收；將甘露聚糖降解為甘露寡糖（MOS），提高畜禽免疫力，有利于腸道內(nèi)有益菌的增殖[8-10]。Pettey等（2002）研究表明，在仔豬日糧中添加β-甘露聚糖酶能顯著提高仔豬采食量，促進(jìn)仔豬日增重，提高豬的生長性能[11]。本試驗(yàn)在仔豬日糧中分別添加2 000、4 000、6 000 U/kg的復(fù)合型β-甘露聚糖酶均能提高其采食量、日增重，且對(duì)采食量、日增重的改善程度隨β-甘露聚糖酶添加量的增加而提高。李學(xué)儉（2012）研究表明在仔豬日糧中添加β-甘露聚糖酶能顯著降低仔豬腹瀉[12]，而本研究中三種添加量的復(fù)合型β-甘露聚糖酶均能顯著降低仔豬腹瀉率，與現(xiàn)有研究結(jié)果是相一致的，這可能與甘露聚糖酶作用于日糧釋放出的甘露寡糖對(duì)畜禽體內(nèi)微生態(tài)平衡的調(diào)節(jié)有關(guān)。

3.3 復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血液生化參數(shù)可反映動(dòng)物機(jī)體的營養(yǎng)水平和健康狀況，其中血液中GLU是動(dòng)物機(jī)體主要的能量來源，其含量高低與動(dòng)物采食量、機(jī)體營養(yǎng)狀況和應(yīng)激水平呈正相關(guān)，血漿TP和ALB含量可反映機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收和代謝狀況[13]。本試驗(yàn)中，日糧添加4 000、6 000 U/kg復(fù)合型β-甘露聚糖酶可顯著提高斷奶仔豬血清中血糖和總蛋白含量，這說明日糧添加β-甘露聚糖酶對(duì)改善斷奶仔豬對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用能力有促進(jìn)作用，這與高玉紅等（2000）的研究結(jié)果基本一致[14]。血漿UN可反映機(jī)體蛋白質(zhì)合成或分解能力，其含量高低可用于評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)代謝和飼糧氨基酸的平衡狀況，IgA和IgG含量可反映動(dòng)物機(jī)體的免疫水平。本試驗(yàn)中，日糧添加不同劑量復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)仔豬血清中UN、IgA和IgG含量無顯著影響，但尿素氮有降低趨勢(shì)，表明斷奶仔豬對(duì)蛋白質(zhì)的利用增強(qiáng)，但呂秋鳳等（2011）研究表明日糧添加復(fù)合酶制劑可提高斷奶仔豬后期血清中IgA含量[15]，這可能與酶的添加劑量、組成等有關(guān)，其具體原因有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

①將酸性β-甘露聚糖酶、中性β-甘露聚糖酶以50∶50的酶活比例組成的復(fù)合型β-甘露聚糖酶對(duì)仔豬日糧有最佳的作用效果；

②復(fù)合型甘露聚糖酶在仔豬日糧中的添加量在4 000～6 000 U/kg時(shí)，能顯著提高仔豬的生長性能，降低仔豬腹瀉率，并顯著提高血清中血糖和總蛋白含量，促進(jìn)機(jī)體代謝。