■程 義 張 蕾 郭曦堯 尚信池 王 楠 劉 佳 張一琳 李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118)

提高健康和效益是水產(chǎn)養(yǎng)殖的一個(gè)重要目標(biāo)，而飼料中添加添加劑是其中重要的手段之一。飼料添加劑是提高飼料性能和動(dòng)物性能的非營(yíng)養(yǎng)性成分。有機(jī)酸及其鹽類具有提高飼料利用率、動(dòng)物生長(zhǎng)性能及抗病性的作用，是潛在的添加劑而被廣泛研究。這些有機(jī)酸包括蟻酸、丙酸、乙酸、丁酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸和山梨酸及其鹽類被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]。有機(jī)酸及其鹽類參與人體的代謝途徑，使ATP在羧酸循環(huán)中產(chǎn)生能量，提高某些營(yíng)養(yǎng)素的消化率[2]。其中檸檬酸（CA）和L-蘋果酸（MA）作為三羧酸循環(huán)（TCA）中重要組成部分而被人們所熟知。檸檬酸可以影響多種魚類的生長(zhǎng)以及消化酶活性。冷向軍等[3]研究表明，基礎(chǔ)飼料中添加0.2%檸檬酸顯著促進(jìn)異育銀鯽幼魚的生長(zhǎng)。黎軍勝等[4]研究表明，添加10 g/kg檸檬酸可以極顯著提高異育銀鯽胃蛋白酶、肝胰臟和腸道淀粉酶活性，同時(shí)極顯著降低腸道蛋白酶活性。L-蘋果酸同樣可以影響魚類消化酶的活性。李贊[5]研究表明，飼料中添加L-蘋果酸可以提高羅非魚胃蛋白酶和肝臟檸檬酸合酶活性及肝臟ATP含量。單獨(dú)探究檸檬酸或L-蘋果酸對(duì)魚類生長(zhǎng)、血液血清相關(guān)指標(biāo)影響的研究較多，但二者聯(lián)合對(duì)魚類影響的研究較少，本試驗(yàn)旨在探究不同添加量的L-蘋果酸和檸檬酸對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和血液及血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響，進(jìn)一步深入探究酸化劑的作用機(jī)制，為異育銀鯽飼料生產(chǎn)中合理添加L-蘋果酸和檸檬酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

L-蘋果酸（MA，Sigma公司）、檸檬酸（CA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）純度均＞99%，并且試劑均為分析純（AR級(jí)），過氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)魚為240尾異育銀鯽，由長(zhǎng)春市新立城水庫(kù)提供。飼養(yǎng)水體為充分曝氣的自來水，水溫維持在(25±2)℃，pH值為6.9～7.4，溶氧5～7 mg/l，氨氮含量為0.4～0.5 mg/l，每缸水體體積為80 L，保持水泵24 h供氧。馴養(yǎng)兩周后，選取健康、規(guī)格均勻的鯽魚進(jìn)行隨機(jī)分組：空白對(duì)照Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組。試驗(yàn)在總結(jié)前人基礎(chǔ)上，異育銀鯽日糧中檸檬酸的最佳添加量為0.2%。這5個(gè)組中Ⅰ組飼喂基礎(chǔ)飼料，其他組基礎(chǔ)飼料中分別添加0.2%CA（Ⅱ組）、0.2%CA+0.1%MA（Ⅲ組）、0.2%CA+0.2%MA（Ⅳ組）、0.2%CA+0.4%MA（Ⅴ組），試驗(yàn)周期為60 d。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)16尾魚，總共15個(gè)水缸。每天飼喂2次（8:00和18：00），投喂量為魚平均體重的3%～4%。試驗(yàn)期間每?jī)商鞊Q一次水，換水量約為70%。

1.3 基礎(chǔ)日糧、試驗(yàn)飼料及營(yíng)養(yǎng)水平

按照NRC魚類營(yíng)養(yǎng)需要設(shè)計(jì)基礎(chǔ)飼料配方，基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）見表1。將5種飼料所有成分分別與適當(dāng)?shù)乃耆旌?，并通過實(shí)驗(yàn)室造粒機(jī)擠出成直徑為2.0 mm的顆粒。制粒溫度為(80±5)℃，50 ℃烘干(含水量17%)，并在4℃冰箱保存。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 樣品處理與采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束，鯽魚停喂24 h，稱量魚體體重。使用1 ml無菌注射器對(duì)每組鯽魚進(jìn)行尾椎靜脈取血，并分裝到無菌促凝管和抗凝管中，4℃保存。魚體組織樣品在冰盤上解剖采集，無菌生理鹽水清洗后用濾紙吸干置于無菌10 ml EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血液及血清生化指標(biāo)的測(cè)定

使用BayerDVIA 120型血細(xì)胞分析儀測(cè)定白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白濃度(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板(PLT)指標(biāo)。使用貝克曼（ProCX4）全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（UREA）、肌酐（CREA）、血糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（AKP）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）指標(biāo)。檢測(cè)地點(diǎn)為吉林省疾病預(yù)防控制中心。

1.6 組織中抗氧化酶的測(cè)定

將保存的肝胰臟組織樣品準(zhǔn)確稱量后，按質(zhì)量（g）∶體積（ml）=1∶9比例加入9倍體積的生理鹽水，使用組織勻漿機(jī)在冰水浴條件下制備勻漿，2 500～3 000 r/min離心10 min，最后吸取上清備用。SOD、CAT活性測(cè)定的具體操作均按南京建成生物工程公司試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

增重率(%)=（Wt-W0）/W0×100

特定生長(zhǎng)率(%/d)=（lnWt-lnW0）/t×100

式中：Wt、W0——分別表示終末均重、初始均重(g)；

t——表示養(yǎng)殖時(shí)間(d)。

存活率(%)=存活尾數(shù)/總尾數(shù)×100

數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 20.0軟件單因素分析法Tukey進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 檸檬酸和L-蘋果酸對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)性能的影響(見表2)

表2 異育銀鯽存活率、增重率及特定生長(zhǎng)率

由表2可知，與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ組異育銀鯽增重率和特定生長(zhǎng)率顯著升高（P＜0.05），最高值均出現(xiàn)在第Ⅳ組。與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽增重率和特定生長(zhǎng)率顯著升高（P＜0.05）；所有組存活率均為100%。

2.2 異育銀鯽血液生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(見表3)

表3 異育銀鯽血液生理指標(biāo)測(cè)定值

由表3可知，相比Ⅱ組，Ⅲ、Ⅳ組異育銀鯽RBC、HGB指標(biāo)顯著升高（P＜0.05），Ⅳ組WBC指數(shù)顯著升高（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組MCH 均顯著升高（P＜0.05），HCT、MCV、MCHC、PLT各組差異均不顯著（P＞0.05）。相比于Ⅰ組，各試驗(yàn)組PLT均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 異育銀鯽血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(見表4)

表4 異育銀鯽血清生化指標(biāo)測(cè)定值

表4（續(xù)） 異育銀鯽血清生化指標(biāo)測(cè)定值

由表4可知，與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽ALT、AST活性均顯著升高（P＜0.05），Ⅳ、Ⅴ組LDH活性均顯著升高（P＜0.05），Ⅳ組AKP活性顯著升高（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ組 ALB、TP濃度均顯著升高（P＜0.05），AKP、ALB、TP最高值均出現(xiàn)在Ⅳ組。與Ⅰ組相比，所有試驗(yàn)組LDH活性、ALB濃度顯著升高（P＜0.05）。各組間UREA、CREA、GLU含量差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 異育銀鯽肝胰臟CAT和SOD活性測(cè)定結(jié)果(見圖1)

圖1 肝胰臟CAT（左）及SOD（右）活性

由圖1可知，與Ⅱ組相比，Ⅲ組SOD活性顯著提高（P＜0.05），Ⅳ、Ⅴ組CAT、SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ組SOD、CAT活性均顯著提高（P＜0.05），Ⅳ組SOD活性顯著升高（P＜0.05），Ⅴ組CAT和SOD活性均顯著降低（P＜0.05）；SOD和CAT活性最高值均出現(xiàn)在第Ⅲ組。

3 討論

3.1 對(duì)生長(zhǎng)性能的影響

飼料中添加有機(jī)酸可有效改善飼料利用率，水生動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，但有機(jī)酸的作用具有高度種屬特異性。Dai等[6]通過在飼料中添加檸檬酸研究其對(duì)幼年大菱鲆生長(zhǎng)性能的影響，結(jié)果表明，添加3%檸檬酸可以提高低磷飼料中P的利用率，而對(duì)生長(zhǎng)性能沒有影響。與此相反，Castillo等[7]研究表明，飼料中添加1.5%檸檬酸可以顯著提高美國(guó)紅魚幼魚生長(zhǎng)性能以及提高胃蛋白酶、胰酶（胰蛋白酶、脂肪酶）和腸道酶（亮氨酸氨肽酶、磷酸酶）的活性。Arshad等[8]通過在飼料中添加有機(jī)酸研究其對(duì)紅海鯛生長(zhǎng)和磷利用的影響，結(jié)果表明，與喂食不含無機(jī)磷飼料組相比，飼喂1%檸檬酸的紅海鯛體重增加，有機(jī)磷利用率提高，飼喂1%蘋果酸對(duì)紅海鯛體重和有機(jī)磷利用率無顯著影響。李贊[5]研究表明，飼料中添加L-蘋果酸可以提高羅非魚腸道消化酶和肝臟檸檬酸合酶活性及肝臟ATP含量。本試驗(yàn)中，酸化劑組異育銀鯽增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于空白對(duì)照組；與只添加0.2%CA組相比，額外添加MA為0.1%或0.2%時(shí)，增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著提高，額外添加0.4%MA增重率和特定生長(zhǎng)率差異不顯著，這可能由于少量L-蘋果酸可以配合檸檬酸與飼料礦物質(zhì)反應(yīng)以及適當(dāng)降低飼料中的pH值，有助于胃蛋白酶消化飼料，而高濃度L-蘋果酸配合檸檬酸可能對(duì)消化酶活性具有負(fù)面作用。

3.2 對(duì)血液生理指標(biāo)的影響

血液生物化學(xué)被廣泛用于魚類研究，反映了魚類的一般健康狀況[9]。Kartik等[10]研究發(fā)現(xiàn)，使用含有3%檸檬酸飼料飼喂南亞野鯪幼魚后，血紅蛋白（HGB）和紅細(xì)胞壓積（HCT）顯著提高，但對(duì)紅細(xì)胞數(shù)量（RBC）無影響。白細(xì)胞是先天免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵組成部分，調(diào)節(jié)免疫功能和魚的抗病能力[11]。本試驗(yàn)中，與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ組RBC、HGB均顯著升高，Ⅳ組WBC數(shù)量顯著升高，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組MCH顯著升高，HCT、MCV、MCHC、PLT各組差異不顯著；與Ⅰ組相比，所有試驗(yàn)組異育銀鯽WBC、RBC、HGB指標(biāo)均高于空白對(duì)照組，而血小板濃度（PLT）指標(biāo)均低于空白對(duì)照組；這些指標(biāo)變化表明添加適宜濃度有機(jī)酸可以提高血液運(yùn)輸氧氣功能，WBC的變化表明檸檬酸和蘋果酸可能影響異育銀鯽的免疫功能，PLT顯著降低表明檸檬酸和L-蘋果酸可能引發(fā)血小板減少癥。

3.3 對(duì)血清生化指標(biāo)的影響

血清學(xué)指標(biāo)可以從側(cè)面反映魚類體內(nèi)新陳代謝狀況。AST和ALT是重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，參與氨基酸代謝。在魚類營(yíng)養(yǎng)研究中，血清AST和ALT有時(shí)被用作評(píng)估肝臟整體健康狀況的指標(biāo)，并以較低濃度存在于血漿中，當(dāng)它們活性增加時(shí)，表明組織出現(xiàn)病變，尤其是肝胰臟[12-13]。本試驗(yàn)中，相比Ⅰ、Ⅱ組，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽血清AST和ALT活性隨著L-蘋果酸濃度增大而上升，表明高濃度的L-蘋果酸損傷異育銀鯽肝臟功能。血清中UREA和CREA水平是評(píng)估腎臟整體健康狀況的重要標(biāo)志物[9]，UREA水平變化反映了動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況，而CREA水平上升大多數(shù)見于腎小球?yàn)V過功能的減退。本試驗(yàn)各個(gè)組間UREA、CREA差異均不顯著，表明通過攝入的方式，L-蘋果酸可能對(duì)異育銀鯽腎臟功能無顯著影響。LDH是一種糖酵解酶，參與能量代謝，幾乎分布于機(jī)體所有組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)機(jī)體組織細(xì)胞受到病變或損傷時(shí)，LDH被釋放到血液中。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組異育銀鯽LDH活性顯著高于空白對(duì)照Ⅰ組；相比于Ⅱ組，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽LDH活性隨著L-蘋果酸濃度增大而上升，其中Ⅳ、Ⅴ組LDH活性顯著提升，表明高濃度L-蘋果酸誘導(dǎo)異育銀鯽肝臟損傷，LDH被大量釋放到血清中。AKP廣泛參與動(dòng)物機(jī)體內(nèi)核酸、蛋白、生物堿等物質(zhì)去磷酸化過程，同時(shí)也是機(jī)體解毒體系的一部分。本試驗(yàn)中，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽AKP活性均顯著高于空白對(duì)照組；相比于Ⅱ組，Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽LDH活性隨著L-蘋果酸濃度增大而顯著上升，表明高濃度蘋果酸可能引起異育銀鯽肝胰臟損傷，機(jī)體內(nèi)AKP含量上升，緩解機(jī)體損傷。TP水平主要反映肝臟合成功能，而ALB是TP的一種，主要起到維持膠體滲透壓、運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)的功能。本試驗(yàn)中，隨著L-蘋果酸濃度提高，各試驗(yàn)組TP和ALB含量表現(xiàn)出先升高再降低趨勢(shì)，但均高于空白對(duì)照組，這可能由于高濃度檸檬酸和L-蘋果酸作為能量物質(zhì)以及毒性物質(zhì)，促進(jìn)TP和ALB的合成，從而緩解機(jī)體和肝臟損傷。

3.4 對(duì)肝胰臟抗氧化酶活性指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)釋放活性氧自由基（ROS），而過量ROS會(huì)積累于肝臟中造成核酸損傷、蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化[14]。抗氧化酶是機(jī)體防御氧化應(yīng)激的重要體系，其中SOD、CAT作為抗氧化防御因子，通過催化ROS發(fā)生歧化反應(yīng)或?qū)C(jī)體內(nèi)過氧化氫還原成水，來實(shí)現(xiàn)抗氧化防御減少機(jī)體損傷[15]。敬婷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中隨著L-蘋果酸添加量的升高，湘云鯽肝臟SOD、蘋果酸脫氫酶（MDH）活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，最高值均出現(xiàn)在4 g/kg添加組，而丙二醛（MDA）含量則相反。這與本試驗(yàn)部分結(jié)果相似，與Ⅱ組相比，隨著L-蘋果酸濃度增高，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽SOD、CAT活性均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；與空白對(duì)照Ⅰ組相比，Ⅴ組CAT、SOD活性顯著降低；SOD、CAT活性最高值均出現(xiàn)在第Ⅲ組；結(jié)果表示，由于檸檬酸和L-蘋果酸可以通過三羧酸循環(huán)相互轉(zhuǎn)換，適宜濃度L-蘋果酸可能促使異育銀鯽機(jī)體產(chǎn)生反饋抵抗機(jī)制以應(yīng)對(duì)應(yīng)激反應(yīng)，隨著酸濃度升高，抗氧化酶活性受到抑制，因而對(duì)機(jī)體造成了氧化損傷。

4 結(jié)論

飼料中適量添加檸檬酸+L-蘋果酸可以顯著提高異育銀鯽的增重率、特定生長(zhǎng)率和抗氧化能力，但過量可能引起肝損傷，血小板降低癥。