萬品文，王 倩，萬 春

(1.南陽市中心醫(yī)院肝臟普外科，河南 南陽 473000；2.南陽市中心醫(yī)院皮膚科，河南 南陽 473000)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，位居胃腸道腫瘤的第3位，好發(fā)于40～50歲的中年人[1]。結(jié)腸癌在北美、歐洲等地區(qū)的發(fā)病率較高，近年來其在中國的發(fā)病率呈不斷上升的趨勢。結(jié)腸癌發(fā)病部位隱匿，早期無明顯癥狀，病情進展緩慢，大部分患者因膿血便、腹痛、貧血、消瘦等癥狀就診，75%的患者在確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預后不良[2]。因此，及時診斷與治療對提高結(jié)腸癌患者生存質(zhì)量、延長生存期至關(guān)重要。白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)是重要的輔助性T細胞2(helper T cell 2，Th2) 類細胞因子之一，在免疫應(yīng)答過程中參與調(diào)控Th2和B細胞。IL-4也參與調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡，在腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。骨膜蛋白(periostin，POSTN)是一種骨黏附因子，主要由成骨細胞及其前體細胞合成，參與細胞募集和黏附過程。研究發(fā)現(xiàn)，POSTN在鼻咽癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中呈高表達，與惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[5-6]。故本研究通過檢測結(jié)腸腺癌組織中IL-4、POSTN的表達水平，探討其對結(jié)腸腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響，旨在為結(jié)腸癌的診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2014年1月至2017年5月南陽市中心醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)腸腺癌標本85例(術(shù)前未進行放射、化學治療或免疫治療)為研究對象。85例結(jié)腸腺癌患者中，男47例，女38例；年齡35～78(47.76±8.53)歲；根據(jù)Duke′s分期標準[7]分為：A期15例，B期30例，C期29例，D期11例；組織分化程度：高分化29例，中分化36例，低分化20例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例。選取同期43例結(jié)腸腺瘤組織標本作為良性對照，其中男24例，女19例；年齡33～75(47.34±7.89)歲；另取結(jié)腸腺癌癌旁正常組織45例作為對照，其中男27例，女18例；年齡36～77(46.25±8.64)歲；癌旁組織所選部位與腫瘤組織間的距離大于 5 cm，且經(jīng)病理診斷證實為正常結(jié)腸黏膜組織。所有受試者簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2主要試劑與儀器蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色液(北京索萊寶科技有限公司)，Envision試劑盒、濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑(丹麥Dako公司)，兔抗人IL-4多克隆抗體(美國CST公司)，兔抗人POSTN多克隆抗體(英國Abcam公司)，山羊抗兔二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphatic buffer solution，PBS)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)，光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3組織標本處理結(jié)腸組織標本一部分立即凍存于液氮中，以備進行Western blot實驗；一部分經(jīng)體積分數(shù)10%甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，組織切片機連續(xù)切成3 μm厚度的切片，每例制作3～5張，置于60 ℃烘箱中烤片2 h，以防止脫片。

1.4HE染色觀察結(jié)腸組織的病理學形態(tài)烘烤后的結(jié)腸組織切片依次用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；蘇木精染細胞核5～10 s；雙蒸水洗滌后，體積分數(shù)1%鹽酸乙醇分化處理5～10 s；雙蒸水洗滌后，伊紅溶液染細胞質(zhì)1～2 min；常規(guī)脫水透明；中性樹膠封片后，在光學顯微鏡下進行常規(guī)組織病理學檢測。

1.5免疫組織化學染色Envision法檢測結(jié)腸組織中POSTN、IL-4蛋白表達烘烤后的結(jié)腸組織切片依次用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、PBS漂洗；于100 ℃檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中高壓修復抗原 3 min，室溫下冷卻，PBS洗滌；滴加體積分數(shù)3%H2O2，室溫孵育10 min使內(nèi)源過氧化物酶失活，PBS沖洗；滴加IL-4(稀釋比150)或POSTN(稀釋比1100)的一抗稀釋液，室溫孵育2 h；滴加Envision二抗溶液，27 ℃孵育30 min，PBS沖洗；滴加新配制的DAB溶液，顯色3～10 min，顯色充分后雙蒸水終止顯色；蘇木精染核3 min后，依次用體積分數(shù)1%鹽酸乙醇分化、雙蒸水洗滌、飽和碳酸鋰藍化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明；中性樹膠封片后，在光學顯微鏡下觀察并拍照。同時，以PBS代替一抗稀釋液作為陰性對照。

1.6免疫組織化學結(jié)果評判標準由本院2位資深的病理科醫(yī)師采用雙盲法閱讀切片。每張切片通過高倍鏡(×400)隨機選擇5個視野，統(tǒng)計每個視野中陽性細胞所占比例，每個視野計數(shù)至少200個細胞。根據(jù)每張切片中陽性細胞所占百分比進行計分，0分：陽性細胞為0；1分：0%<陽性細胞所占百分比<25%；2分：25%≤陽性細胞所占百分比<50%；3分：50%≤陽性細胞所占百分比<80%；4分：陽性細胞所占百分比≥80%；根據(jù)陽性細胞染色強度計分：淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終根據(jù)二者計分的乘積確定結(jié)果，陰性：0～3分，弱陽性：4～6分，中等陽性：7～9分，強陽性：10～12分。陰性和弱陽性定義為低表達，中等陽性和強陽性定義為高表達。

1.7Westernblot檢測結(jié)腸組織中POSTN、IL-4蛋白表達取50 mg液氮凍存的結(jié)腸組織，充分研磨，采用常規(guī)方法提取結(jié)腸組織蛋白。取適量蛋白質(zhì)樣品，采用二喹啉甲酸法定量以調(diào)節(jié)濃度。將50 μg 蛋白樣品和適量十二烷基硫酸鈉緩沖液充分混合，煮沸10 min使蛋白變性；聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)分離；將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上；TBST緩沖液清洗膜后，將膜置于50 g·L-1牛血清蛋白溶液，室溫封閉1 h；TBST緩沖液清洗膜后，將膜置于IL-4(稀釋比 11 000)或POSTN(稀釋比 11 000)的一抗稀釋液中，4 ℃孵育過夜；TBST緩沖液洗膜后置于相應(yīng)的二抗稀釋液(稀釋比14 000)中，室溫孵育2 h；TBST緩沖液洗膜后置于新配制的電化學發(fā)光顯色液中顯色，條帶清晰出現(xiàn)后終止；用ImageScanner掃描蛋白膠片，用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的凝膠電泳圖分析軟件(Quantity One)分析蛋白條帶灰度值。選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1不同結(jié)腸組織病理組織學變化結(jié)果見圖1。HE染色結(jié)果顯示，癌旁正常結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，腺體細胞排列整齊、緊密；結(jié)腸腺瘤組織腺體細胞明顯增大，排列疏松；結(jié)腸腺癌組織結(jié)構(gòu)明顯異常，腺體細胞排列紊亂，間隙擴大。

A：癌旁正常結(jié)腸組織；B：結(jié)腸腺瘤組織；C：結(jié)腸腺癌組織。

圖1不同結(jié)腸組織HE染色結(jié)果(×200)

Fig.1HEstainingresultsofdifferentcolontissues(×200)

2.2不同結(jié)腸組織中IL-4蛋白的表達結(jié)果見圖2。IL-4蛋白主要在細胞膜及細胞質(zhì)表達，呈黃色或棕黃色彌漫分布。IL-4蛋白在癌旁正常結(jié)腸組織、結(jié)腸腺瘤組織、結(jié)腸腺癌組織中低表達率分別為86.67%(39/45)、58.14%(25/43)、31.76%(27/85)，高表達率分別為13.33%(6/45)、41.86%(18/43)、68.24%(58/85)。IL-4蛋白在結(jié)腸腺癌組織、結(jié)腸腺瘤組織及癌旁正常結(jié)腸組織中的高表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=36.275，P=0.000)；其中，結(jié)腸腺癌組織中IL-4蛋白高表達率顯著高于結(jié)腸腺瘤組織和癌旁正常結(jié)腸組織(χ2=8.235，P=0.004；χ2=35.484，P=0.000)，結(jié)腸腺瘤組織中IL-4蛋白高表達率顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織(χ2=9.022，P=0.003)。

A：癌旁正常結(jié)腸組織；B：結(jié)腸腺瘤組織；C：結(jié)腸腺癌組織。

圖2IL-4蛋白在不同結(jié)腸組織中的表達(Envision染色，×400)

Fig.2ExpressionofIL-4proteinindifferentcolontissues(Envisiondyeing，×400)

2.3不同結(jié)腸組織中POSTN的表達結(jié)果見圖3。POSTN彌漫分布于細胞膜及細胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色。POSTN在癌旁正常結(jié)腸組織、結(jié)腸腺瘤組織、結(jié)腸腺癌組織中的低表達率分別為82.22%(37/45)、44.19%(19/43)、27.06%(23/85)，高表達率分別為17.78%(8/45)、55.81%(24/43)、72.94%(62/85)。POSTN在癌旁正常結(jié)腸組織、結(jié)腸腺瘤組織、結(jié)腸腺癌組織中的高表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=36.135，P=0.000)；其中，結(jié)腸腺癌組織中POSTN高表達率高于結(jié)腸腺瘤組織，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.799，P=0.051)，結(jié)腸腺癌組織和結(jié)腸腺瘤組織中POSTN高表達率顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=36.027、13.747，P=0.000)。

A：癌旁正常結(jié)腸組織；B：結(jié)腸腺瘤組織；C：結(jié)腸腺癌組織。

圖3POSTN在不同結(jié)腸組織中的表達(Envision染色，×400)

Fig.3ExpressionofPOSTNindifferentcolontissues(Envisiondyeing，×400)

2.4POSTN和IL-4蛋白表達與結(jié)腸腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表1。結(jié)腸腺癌組織中POSTN、IL-4蛋白表達與患者的Duke′s分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P=0.001、0.011、0.009)，與性別、腫瘤大小、大體類型無關(guān)(P=0.262、0.534、0.447)。

表1POSTN、IL-4蛋白表達與結(jié)腸腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1RelationshipbetweentheexpressionofPOSTNandIL-4proteinandtheclinicopathologicalfeaturesofpatientswithcolonadenocarcinoma例(%)

2.5不同結(jié)腸組織中POSTN、IL-4蛋白相對表達量比較結(jié)果見表2和圖4。結(jié)腸腺癌組織和結(jié)腸腺瘤組織中POSTN、IL-4蛋白表達水平均高于癌旁正常結(jié)腸組織(P<0.05)；結(jié)腸腺癌組織中POSTN、IL-4蛋白表達水平均高于結(jié)腸腺瘤組織(P<0.05)。

表2不同結(jié)腸組織中POSTN、IL-4蛋白相對表達量比較

組別nIL-4蛋白POSTN癌旁正常結(jié)腸組織450.183±0.0350.254±0.042結(jié)腸腺瘤組織430.296±0.027a0.582±0.122a結(jié)腸腺癌組織850.735±0.128ab0.804±0.154abF637.245281.751P0.0000.000

注：與癌旁正常結(jié)腸組織比較aP<0.05；與結(jié)腸腺瘤組織比較bP<0.05。

1：癌旁正常結(jié)腸組織；2：結(jié)腸腺瘤組織；3：結(jié)腸腺癌組織。

圖4不同結(jié)腸組織中POSTN和IL-4蛋白的表達(Westernblot)

Fig.4ExpressionofPOSTNandIL-4proteinindifferentcolontissues(Westernblot)

2.6結(jié)腸腺癌組織中POSTN與IL-4表達的相關(guān)性結(jié)腸腺癌組織中POSTN與IL-4蛋白表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.496，P=0.002)。

3 討論

隨著經(jīng)濟水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)腸腺癌在中國的發(fā)病率逐年上升。目前，有研究者認為，80%以上的結(jié)直腸癌是由腺瘤惡化后形成，結(jié)腸腺瘤是腺上皮異型增生而產(chǎn)生的良性腫瘤，臨床上常認為結(jié)腸腺瘤性息肉為結(jié)腸腺癌的癌前病變[8]。有研究顯示，結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸腺癌的發(fā)病特征類似[9]。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，單個結(jié)腸腺瘤患者罹患結(jié)腸腺癌的風險是無腺瘤者的6倍，多個結(jié)腸腺瘤患者罹患結(jié)腸腺癌的風險是單個腺瘤者的2倍[10]。結(jié)腸腺癌的發(fā)生過程常伴隨著致癌基因激活、抑癌基因失活等多類基因的突變，結(jié)腸腺瘤和腺癌間的基因改變情況基本一致，結(jié)腸腺瘤的5號和18號染色體的等位基因分別缺失20%和47%，結(jié)腸腺癌分別缺失36%和73%，由結(jié)腸腺瘤轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)腸腺癌大概需10～15 a[11]，通常腺瘤體積越大，數(shù)目越多，絨毛量越多，患者年齡越大，癌變的可能性就越大。因此，及早診斷并在內(nèi)鏡下摘除結(jié)腸腺瘤對防止結(jié)腸腺癌的發(fā)生具有重要意義。

細胞因子表達失衡存在于不同類型的腫瘤中，與惡性腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究表明，大部分乳腺癌、前列腺癌或結(jié)腸癌患者血清中IL-4、IL-6和IL-8蛋白表達水平較健康者升高[12]。IL-4主要由CD4+T細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞等合成分泌，是人體重要的Th2類抑炎性細胞因子，能夠調(diào)節(jié)Th1與Th2之間的免疫炎癥過程。正常生理條件下，促炎性和抑炎性細胞因子處于相對平衡狀態(tài)，以保證機體正常的免疫功能。當外源性或內(nèi)源性刺激引起促炎性和抑炎性細胞因子平衡失調(diào)時，會導致免疫異常，腸道一直處于免疫炎癥狀態(tài)時，導致消化系統(tǒng)異常、炎性增生甚至發(fā)生惡性腫瘤等[13-14]。IL-4在結(jié)腸腺癌及其他惡性腫瘤中表達上調(diào)，具有抵抗腫瘤細胞凋亡的作用，IL-4通過促進抗凋亡因子survivin轉(zhuǎn)錄表達來調(diào)控抗凋亡過程[15-16]。目前，IL-4在結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸腺癌組織中的表達情況還未見報道。本研究免疫組織化學檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-4蛋白在結(jié)腸腺癌組織中的高表達率顯著高于結(jié)腸腺瘤組織和癌旁正常結(jié)腸組織，IL-4蛋白在結(jié)腸腺瘤組織中的高表達率顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織，說明IL-4可能參與了結(jié)腸腺瘤及腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，提示檢測結(jié)腸腺瘤組織中IL-4水平可能成為預測腺瘤癌變風險的指標。結(jié)腸腺癌組織中IL-4表達與患者的Duke′s分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，說明IL-4表達與結(jié)腸腺癌的嚴重程度密切相關(guān)，檢測結(jié)腸腺癌組織中IL-4水平可在一定程度上反映結(jié)腸腺癌患者的病情發(fā)展進程。本研究中Western blot結(jié)果也證實，結(jié)腸腺癌組織中IL-4蛋白水平顯著高于結(jié)腸腺瘤組織，結(jié)腸腺瘤組織中IL-4蛋白表達水平顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織，進一步說明IL-4可能參與了結(jié)腸腺瘤及腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

POSTN基因位于人13號染色體上，大小約為36 kb，編碼2種亞型，一種為骨肉瘤亞型，編碼蛋白含有836個氨基酸；一種為胎盤亞型，編碼蛋白含有779個氨基酸。POSTN作為一種骨黏附因子，不僅參與成骨細胞的增殖、分化、黏附以及伸展過程，還可促進骨膜成骨前體細胞的聚集、黏附，同時也參與了間質(zhì)平滑肌細胞的遷移過程，在人體多種組織中普遍表達[3]。多項研究表明，POSTN在非小細胞肺癌、乳腺癌、肝細胞癌、結(jié)腸腺癌等多種癌癥中呈高表達[6，17-20]。POSTN能夠促進血管生成以保證腫瘤細胞的存活，在惡性腫瘤的侵襲、遷移中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-4和IL-13可促進肺成纖維細胞分泌POSTN，在支氣管哮喘患者的上皮纖維化過程中POSTN處于IL-4和IL-13信號的下游[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)，IL-4和POSTN在慢性鼻竇炎患者的鼻息肉中均呈高表達，且二者的表達水平呈顯著正相關(guān)。本研究免疫組織化學檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POSTN在結(jié)腸腺癌組織中的高表達率高于結(jié)腸腺瘤組織和癌旁正常結(jié)腸組織，POSTN蛋白在結(jié)腸腺瘤組織中的高表達率顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織，說明POSTN與IL-4一樣，也參與了結(jié)腸腺瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，提示檢測結(jié)腸腺瘤組織中POSTN水平可在一定程度上預測結(jié)腸腺瘤癌變的風險。結(jié)腸腺癌組織中POSTN表達與患者的Duke′s分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，表明檢測結(jié)腸腺癌組織中POSTN水平能夠反映結(jié)腸腺癌患者的病情嚴重程度。本研究中Western blot檢測結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸腺癌組織中POSTN表達水平顯著高于結(jié)腸腺瘤組織，結(jié)腸腺瘤組織中POSTN表達水平顯著高于正常結(jié)腸組織，且結(jié)腸腺癌組織中POSTN與IL-4蛋白表達水平呈顯著正相關(guān)，進一步表明POSTN的高表達與結(jié)腸腺瘤及腺癌的發(fā)生、發(fā)展均有關(guān)。

綜上所述，IL-4、POSTN在結(jié)腸腺癌中的表達顯著高于結(jié)腸腺瘤，在結(jié)腸腺瘤中的表達顯著高于癌旁正常組織，說明IL-4、POSTN的高表達與結(jié)腸腺瘤及腺癌的發(fā)生、發(fā)展均有關(guān)，檢測IL-4、POSTN水平可預測腺瘤癌變的風險。然而，結(jié)腸腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制復雜，IL-4、POSTN能否作為結(jié)腸腺癌診斷及治療的獨立因子還需深入研究。