石江鵬 ，張春芬 ，鄧 舒 ，侯麗媛 ，肖 蓉 ，李芙蓉 ，董艷輝 ，聶園軍 ，曹秋芬 ，

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，山西太原030031）

蘋(píng)果為溫帶水果的一種，大多數(shù)溫帶水果的特點(diǎn)是育種周期長(zhǎng)，童期長(zhǎng)達(dá)5～7 d，高度雜合且異花授粉，通過(guò)傳統(tǒng)育種手段改變性狀遺傳信息需要花費(fèi)大量的時(shí)間，育種目標(biāo)也具有隨機(jī)性[1]。單倍體育種是現(xiàn)代育種的一項(xiàng)重要手段，通過(guò)雄核離體培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)）和雌核離體培養(yǎng)（未授粉子房或胚珠、輻照花粉培養(yǎng)等）等方法誘導(dǎo)產(chǎn)生具有單套染色體的單倍體植株，再利用秋水仙素誘導(dǎo)等方法進(jìn)行染色體加倍形成雙單倍體（Double Haploid，DH）純合再生株系，可提高育種效率、擴(kuò)大親本選擇范圍、減少基因重組數(shù)量[2]。單倍體和雙單倍體作為基礎(chǔ)研究材料，在突變的研究中可用于篩選隱性突變體，可以提高遺傳分析、圖譜構(gòu)建、基因定位的效率及降低基因組測(cè)序成本[3]。單倍體育種豐富了種質(zhì)資源，加快了育種進(jìn)程，在科學(xué)研究中具有重要意義[4]。

果樹(shù)花藥培養(yǎng)開(kāi)始于20世紀(jì)70年代，目前已在梨[5]、棗[6]、柑橘[7]、草莓[8]等多種植物中獲得了成功應(yīng)用。1981年，國(guó)內(nèi)獲得了黃太平、元帥蘋(píng)果花藥培養(yǎng)再生植株[9-10]。TSUKUNI等[11]和 OKADA 等[12]成功獲得蘋(píng)果花藥培養(yǎng)再生植株后，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)再生植株來(lái)源，并對(duì)純合再生株系進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。H?FER等[13]經(jīng)過(guò)多年研究得出，蘋(píng)果花藥培養(yǎng)所得純合再生植株與雜合供體相比結(jié)實(shí)率較低，且形態(tài)特征發(fā)生了改變。在此基礎(chǔ)上，ZHANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，處于單核晚期或雙核早期的小孢子可顯著提高蘋(píng)果花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率，對(duì)花藥進(jìn)行4℃低溫預(yù)處理20～30 d，胚狀體誘導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)。羅慧珍等[15]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法分析低溫誘導(dǎo)對(duì)蘋(píng)果花藥基因的調(diào)控，結(jié)果表明，蔗糖、淀粉生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)變化是影響小孢子獲得胚性潛能的關(guān)鍵。溫鑫等[16]利用流式細(xì)胞儀對(duì)蘋(píng)果花藥離體培養(yǎng)獲得再生植株進(jìn)行倍性分析，再選用蘋(píng)果SSR（HIDRAS）標(biāo)記鑒定再生植株基因型，經(jīng)檢測(cè)，再生株系全部為純合基因型，包括單倍體、二倍體、四倍體。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)蘋(píng)果花藥培養(yǎng)的研究不斷發(fā)展，但關(guān)于蘋(píng)果花藥培養(yǎng)再生植株移栽技術(shù)的相關(guān)研究報(bào)道尚未得到大量有效的驗(yàn)證，因此探究蘋(píng)果花藥培養(yǎng)試管苗的移栽條件可以更好地選出優(yōu)良的蘋(píng)果新種質(zhì)。

本研究以丹霞蘋(píng)果花藥培養(yǎng)的8個(gè)純合再生株系為材料[16-18]，每個(gè)純合再生植株均由不同的花粉粒分化而來(lái)，因此，不同的株系根系生長(zhǎng)狀態(tài)、葉片形態(tài)特征具有差異性。通過(guò)對(duì)每個(gè)株系試管苗的根系生長(zhǎng)特性、葉片形態(tài)特征進(jìn)行觀察分析，選出具有優(yōu)良性狀的株系，對(duì)蘋(píng)果種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所蘋(píng)果基地的丹霞蘋(píng)果品種的健壯花蕾，將其經(jīng)低溫預(yù)處理、消毒，在無(wú)菌操作臺(tái)中將花藥接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（N6＋2.0～3.0 mg/L 6-BA＋0～0.15 mg/L NAA），于25℃在恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。將長(zhǎng)至1 cm左右的胚狀體轉(zhuǎn)入胚狀體分化培養(yǎng)基（MS＋1.0～5.0 mg/L6-BA＋0.1～0.3 mg/LIBA＋3%蔗糖＋0.6%瓊脂），20 d左右分化出幼芽。經(jīng)繼代培養(yǎng)獲得再生植株[1]。本研究以丹霞蘋(píng)果純合基因型DH3-1，DH3-2，DH3-3，DH3-4，DH3-5，DH3-6，DH3-7，DH3-8株系為材料[16]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根系的誘導(dǎo)及測(cè)定 從繼代組培苗中選取生長(zhǎng)旺盛的再生植株接種于生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1/2 MS＋2.0 mg/LIBA＋2%蔗糖＋0.6%瓊脂）。每個(gè)株系接種15株，置于溫室光照培養(yǎng)（25℃3 000 lx；光照14h，黑暗10 h；相對(duì)濕度70%），40 d后選取5個(gè)植株用鑷子挑選出培養(yǎng)基中的全部根系，觀察并測(cè)定根的長(zhǎng)度和根的數(shù)量，拍照記錄。

1.2.2 葉片性狀的觀察及測(cè)定 從生根試管苗中選取葉片充分展開(kāi)和成熟的植株（莖中部葉片），每個(gè)株系取5個(gè)植株，每株選取3個(gè)葉片，每個(gè)株系共測(cè)量15個(gè)葉片。將葉片用清水洗干凈后鋪平放入含有濾紙的自封袋中，注明株系號(hào)。測(cè)量每個(gè)葉片的葉長(zhǎng)度、葉寬度（最大葉寬度）、葉柄長(zhǎng)度。計(jì)算葉形指數(shù)（葉長(zhǎng)度/葉寬度）。觀察葉色、葉緣變異，并拍照。觀察記載方法參照《果樹(shù)種質(zhì)資源描述符：記載項(xiàng)目及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》[19]進(jìn)行。

1.2.3 再生植株移栽技術(shù)研究 選擇生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)茁壯的苗，即葉色濃綠，根系發(fā)達(dá)，以在組培瓶中株高較高的為佳。將組培苗進(jìn)行煉苗，煉苗方法設(shè)2個(gè)處理，分別為開(kāi)蓋后直接移栽和溫室中閉蓋放置5～7 d，開(kāi)蓋加入蒸餾水放置2～3 d后移栽，每個(gè)處理5個(gè)植株。移栽時(shí)先把基質(zhì)（草炭∶蛭石∶珍珠鹽為1∶1∶1）裝至盆的4/5，將取出的試管苗在清水中洗凈根部殘留的瓊脂后移栽進(jìn)基質(zhì)中，立即用清水澆透，并罩上透明杯，注明移栽日期和株系號(hào)。置于光照培養(yǎng)箱，15 d后去掉透明杯，每周澆一次營(yíng)養(yǎng)液（1/2MS＋2 mg/LIBA）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析，使用SPSS 20.0軟件對(duì)不同處理進(jìn)行多重比較、單因素方差分析，顯著性水平設(shè)定為α＝0.05，圖表中所有數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同株系根系形態(tài)特征分析

通過(guò)對(duì)丹霞蘋(píng)果純合基因型株系的根系形態(tài)進(jìn)行分析（表 1、圖 1），結(jié)果表明，DH3-8，DH3-4 株系的根數(shù)、根長(zhǎng)顯著高于其他6個(gè)株系（P＜0.05），根長(zhǎng)分別為26.53，27.70 cm，根數(shù)分別為39.00，51.67 個(gè)（圖 1-A，B）；DH3-1，DH3-3，DH3-6 株系的根長(zhǎng)、根數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），與 DH3-4，DH3-8相比顯著減小，根長(zhǎng)為16.67～20.50 cm，根數(shù)為13.33～15.33 個(gè)（圖 1-C～E）；DH3-2，DH3-5，DH3-7株系的根長(zhǎng)、根數(shù)與其他5個(gè)株系相比顯著較?。≒＜0.05）（圖 1-F～H），其中，DH3-7 株系根長(zhǎng)、根數(shù)最小，分別為7.67 cm，4.33個(gè)（圖1-H）?？梢?jiàn)，丹霞蘋(píng)果純合基因型8個(gè)株系的根系形態(tài)特征具有差異性，DH3-4，DH3-8株系根的生長(zhǎng)狀態(tài)較好。

表1 丹霞蘋(píng)果純合基因型株系根系形態(tài)特征

2.2 不同株系葉片形態(tài)特征分析

從表2可以看出，丹霞蘋(píng)果純合基因型株系的葉片形態(tài)特征如葉片寬度、葉片長(zhǎng)度、葉柄長(zhǎng)度具有明顯差異，DH3-3，DH3-4株系的葉片寬度較寬，分別為 1.90，1.73 cm（圖 2-A，B），顯著寬于其他株系；DH3-8，DH3-1，DH3-6，DH3-5 株系間葉片寬度無(wú)差異（圖2-C～F），但顯著寬于DH3-2株系，DH3-2株系葉片寬度僅為1.00cm（圖2-H）。DH3-7株系的葉片長(zhǎng)度顯著較短，為1.83 cm（圖2-G），但與其他7個(gè)株系的葉片長(zhǎng)度未達(dá)到差異顯著水平。不同株系具有不同的葉柄長(zhǎng)度，DH3-3，DH3-8株系的葉柄長(zhǎng)度較長(zhǎng)，分別為1.30，1.37 cm（圖2-A，C），DH3-2株系的葉柄長(zhǎng)顯著最短，為0.47cm（圖2-H）。葉形指數(shù)在不同株系間表現(xiàn)差異顯著，DH3-6株系的葉形指數(shù)顯著較大，表明葉片為窄長(zhǎng)形（圖2-E），DH3-3株系的葉形指數(shù)顯著最小，表明葉片呈闊圓形（圖2-A），DH3-1，DH3-5株系的葉形指數(shù)差異不顯著，二者的葉片形狀相似（圖2-D，F(xiàn)）。

表2 丹霞蘋(píng)果純合基因型株系葉片形態(tài)特征比較

葉緣、葉色、葉片形狀等的變異，不同的株系表現(xiàn)不一致。DH3-3株系葉基為楔形（圖2-A），DH3-4株系為寬楔形（圖2-B），而DH3-6株系的葉基為偏斜（圖 2-E）；從葉尖來(lái)看，DH3-4，DH3-7株系的葉尖為銳尖（圖 2-B，G），DH3-3，DH3-8，DH3-6 株系的為漸尖 （圖 2-A，C，E），DH3-1，DH3-5株系為突尖（圖2-D，F(xiàn)），DH3-2株系葉尖呈撕裂狀（圖2-H）；分析每個(gè)株系的葉片形狀，DH3-3，DH3-4株系葉片形狀為卵形（圖2-A，B），DH3-8，DH3-1，DH3-6，DH3-5，DH3-7 為 橢 圓 形（圖2-C～G），DH3-2為畸形葉片（圖2-H）；不同株系葉緣鋸齒的變異也表現(xiàn)出多樣性，DH3-3株系為圓齒狀（圖2-A），DH3-8，DH3-6株系為鋸齒狀（圖2-C，E），DH3-4，DH3-2 株系為重鋸齒狀（圖 2-B，H）；就葉色而言，DH3-3，DH3-4，DH3-1 株系葉色較深（圖 2-A，B，D）。

綜上所述，DH3-3，DH3-4，DH3-8 株系的葉片寬度、長(zhǎng)度、葉柄長(zhǎng)度優(yōu)于其他株系，所以，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系的綜合性狀較好。丹霞蘋(píng)果純合基因型株系的葉基、葉尖、葉片形狀、葉緣、葉色具有差異性，就葉片的形態(tài)而言，每個(gè)株系均具有唯一性。

2.3 再生植株移栽分析

丹霞蘋(píng)果純合基因型株系移栽過(guò)程如圖3所示。溫室中閉蓋放置5～7 d，開(kāi)蓋加入蒸餾水放置2～3 d，植株在煉苗過(guò)程中死亡（圖3-A），沒(méi)有株系成活。開(kāi)蓋后直接移栽植株生長(zhǎng)狀態(tài)較好（圖3-B，C），有3個(gè)株系成活，成活率達(dá)到37.50%。

3 討論

蘋(píng)果花藥培養(yǎng)是指將發(fā)育到一定階段的花藥在消毒處理后接種到人工培養(yǎng)基上，花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株有2種途徑：一是花藥改變?cè)瓉?lái)的發(fā)育過(guò)程直接形成胚狀體，經(jīng)培養(yǎng)后形成再生植株（胚胎發(fā)生系統(tǒng)）；二是誘導(dǎo)花藥增殖形成愈傷組織，再誘導(dǎo)分化成胚狀體，繼而形成單倍體植株（器官發(fā)生途徑）。由于受花粉壁等體細(xì)胞的干擾，所以通過(guò)花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得的再生植株可能是雜合植株，因此，花藥培養(yǎng)再生植株需要經(jīng)同工酶、S等位基因、分子標(biāo)記等方法進(jìn)行純合性鑒定。H?FER等[20]選用磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（PGI）、蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）對(duì)蘋(píng)果花藥培養(yǎng)再生植株進(jìn)行同工酶分析，經(jīng)鑒定獲得的植株均為單倍體來(lái)源。SSR分子標(biāo)記法目前應(yīng)用較為廣泛，H?FER等[13]通過(guò)SSR標(biāo)記證明，Pirina，Rene蘋(píng)果花藥培養(yǎng)再生新種質(zhì)的純合性。溫鑫等[16]利用來(lái)自HISDAS的130個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)嘎啦、丹霞、富士3個(gè)蘋(píng)果品種的花藥培養(yǎng)再生植株進(jìn)行PCR，篩選出可區(qū)分再生植株為純合基因型的SSR標(biāo)記。本研究丹霞的8個(gè)花藥培養(yǎng)再生植株經(jīng)SSR鑒定均為純合基因型[16-17]。

VANWYNSBERGHE等[21]研究表明，蘋(píng)果花藥來(lái)源純合基因型株系生長(zhǎng)較慢，部分品系發(fā)生異常分枝，花粉發(fā)芽率差，果實(shí)顯著變小。H?FER等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與供體植株相比，蘋(píng)果花藥來(lái)源的植株移栽到田間后樹(shù)和花的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變。本研究中，丹霞蘋(píng)果純合基因型8個(gè)株系的根系形態(tài)特征、葉片形態(tài)特征表現(xiàn)出明顯差異。DH3-4，DH3-8株系的根數(shù)最多、根長(zhǎng)最長(zhǎng)，DH3-1，DH3-3，DH3-6株系的根長(zhǎng)、根數(shù)次之。DH3-3，DH3-4，DH3-8株系的葉片寬度、長(zhǎng)度、葉柄長(zhǎng)度優(yōu)于其他株系。不同株系的葉緣、葉色、葉片形狀等也存在差異，其中，如DH3-3株系葉基為楔形、葉片形狀為卵形、葉色較深、葉緣鋸齒為圓齒狀；DH3-4株系葉基寬楔形、葉尖為銳尖，葉片形狀為卵形、葉色較深、葉緣鋸齒為重鋸齒狀；DH3-8株系葉基為楔形、葉尖為漸尖，葉片形狀為橢圓形、葉緣為鋸齒狀。蘋(píng)果花藥來(lái)源株系表型多樣性可能是由于潛在隱性基因表達(dá)，每個(gè)株系含有不同的基因型，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的性狀[20]。

本研究進(jìn)行煉苗時(shí)采用2種方法，分別為開(kāi)蓋后直接移栽和溫室中閉蓋放置5～7 d，開(kāi)蓋加入蒸餾水后放置2～3 d移栽。其中，開(kāi)蓋后直接移栽成活株系為3株，成活率達(dá)到37.50%；溫室中閉蓋放置5～7 d，開(kāi)蓋加入蒸餾水后放置2～3 d移栽，成活率為0。開(kāi)蓋后直接移栽比開(kāi)蓋放置2～3 d后移栽成活率高，可能是由于開(kāi)蓋放置2～3 d的過(guò)程中，瓶蓋去掉后葉片水分嚴(yán)重散失而導(dǎo)致植株很快枯萎，若只將蓋擰松而不全部去掉，培養(yǎng)基霉菌繁殖致使植株死亡。開(kāi)蓋后直接移栽到含有草炭、蛭石、珍珠鹽的基質(zhì)中，然后在剛移栽的植株外罩上透明杯，可以避免霉菌繁殖，減少植株水分散失。謝璇等[22]以紅富士蘋(píng)果組培苗為試材，采用水培煉苗的方法，即將組培苗閉瓶培養(yǎng)在改良的霍格蘭德?tīng)I(yíng)養(yǎng)液中（霍格蘭德配方用量減少1/2[23]），室內(nèi)自然光下培養(yǎng)14 d后，再用改良的霍格蘭德全營(yíng)養(yǎng)液開(kāi)瓶煉苗21 d后移栽，這種方法提高了移栽成活率。也有研究表明，水培煉苗可避免培養(yǎng)基干裂、霉菌過(guò)多繁殖，鍛煉組培苗根系的吸水能力，使移栽成活率提高[24-25]。

4 結(jié)論

丹霞蘋(píng)果花藥培養(yǎng)獲得的8個(gè)純合基因型株系中，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系優(yōu)于同一品種其他株系（根系較長(zhǎng)、數(shù)量較多，葉片寬度、長(zhǎng)度、葉柄長(zhǎng)度較長(zhǎng)）。丹霞蘋(píng)果純合基因型株系的葉緣、葉色、葉尖、葉基、葉片形狀表現(xiàn)出明顯差異。丹霞蘋(píng)果純合基因型株系不經(jīng)過(guò)煉苗而直接移栽植株生長(zhǎng)狀態(tài)更好。