周 倩

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病，全球每年流行病都會(huì)導(dǎo)致許多人感染甚至死亡，接種疫苗仍然是預(yù)防流感和降低相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要措施。目前，國(guó)內(nèi)外仍在大量使用雞胚生產(chǎn)流感疫苗，為了克服雞胚擴(kuò)增流感病毒抗原變體的出現(xiàn)，以及季節(jié)性流感疫苗需求的增加和高致病性禽流感病毒帶來(lái)的威脅的需求，基于細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗生產(chǎn)技術(shù)成為一種有吸引力的選擇[1]。本文主要介紹幾種制備流感疫苗的細(xì)胞基質(zhì)，并敘述細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗的方法。

1 MDCK細(xì)胞

MDCK細(xì)胞系是從犬腎臟組織中分離培養(yǎng)獲得的呈上皮樣型的貼壁細(xì)胞，在2007年6月EMEA批準(zhǔn)了一種由Novartis Vaccines生產(chǎn)的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)衍生流感疫苗Optaflu。Kim等人[2]研究表明A/Puerto/8/1934（H1N1）疫苗種子株可以產(chǎn)生適應(yīng)MDCK的高生長(zhǎng)流感疫苗株，當(dāng)A/Puerto/8/1934疫苗株在MDCK細(xì)胞中連續(xù)傳代時(shí)，親本PR8病毒可在MDCK細(xì)胞48小時(shí)達(dá)到約6.83 log10PFU/mL感染性病毒滴度。

Tsai等人[3]研究發(fā)現(xiàn)MDCK/London（MDCK/Ln）細(xì)胞中H1N1、H3N2和H9N2的病毒滴度高于常規(guī)MDCK細(xì)胞中的病毒滴度，與Mv1Lu細(xì)胞中的滴度相當(dāng)，而且流感病毒顆粒更容易從MDCK / Ln細(xì)胞中釋放，除此之外MDCK / Ln比常規(guī)MDCK細(xì)胞具有更快的生長(zhǎng)速率[4]。Abdoli等人[5]研究發(fā)現(xiàn)MDCK-SIAT1細(xì)胞中生長(zhǎng)的流感病毒H1N1獲得的產(chǎn)量幾乎與MDCK相同，并且在MDCK-SIAT1中生長(zhǎng)的H3N2病毒具有更低的病毒滴度。

2 Vero細(xì)胞

Vero細(xì)胞系是從正常成年非洲綠猴腎臟中分離培養(yǎng)而建立的，也是監(jiān)管機(jī)構(gòu)最廣泛接受的連續(xù)細(xì)胞系（CCL），并且已用于生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎和狂犬病病毒疫苗超過(guò)30年，也可以用于生產(chǎn)口服疫苗，比如滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗[6]。用于疫苗生產(chǎn)的Vero細(xì)胞系的主要優(yōu)點(diǎn)是可以在微載體珠上生長(zhǎng)和感染，在感染時(shí)未產(chǎn)生干擾素[7]，且在一定的傳代數(shù)下顯示出非致瘤性，不含外來(lái)因子，適用于已經(jīng)存在疫苗的不同病毒[8]。

Yu等人[9]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)選用適應(yīng)Vero細(xì)胞的高產(chǎn)流感病毒A/Yunnan/1/2005Va（H3N2）和B/Yunnan/2/2005Va（B）作為供體病毒來(lái)構(gòu)建高產(chǎn)野生流感病毒時(shí)，在重組和傳代后獲得新的疫苗株可以完全的保持其原始野生流感病毒的免疫原性，還可以在Vero細(xì)胞中高產(chǎn)量的生長(zhǎng)。

Yang等人[10]研究發(fā)現(xiàn)一種具有安全性和免疫原性的新型Vero和冷適應(yīng)減毒活B型流感疫苗，而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明重配病毒具有良好的活體衰減，還通過(guò)腹膜內(nèi)注射和鼻內(nèi)注射來(lái)證明疫苗具有安全性和免疫原性。

3 PER.C6細(xì)胞

PER.C6細(xì)胞系來(lái)自人視網(wǎng)膜細(xì)胞，該細(xì)胞系可通過(guò)反向遺傳學(xué)的方法產(chǎn)生病毒種子[11]，且在沒(méi)有血清或微載體的情況下可以在大型生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)至高密度，并被證明不含外來(lái)因子和逆轉(zhuǎn)錄酶活性[12]。

Pau等人[13]研究發(fā)現(xiàn)從3 L灌注生物反應(yīng) 器 中 感 染 3×106個(gè) PER.C6細(xì) 胞 /ml， A/Sydney/5/97的病毒滴度是1010TCID50/ml，略高于從MDCK或Vero細(xì)胞獲得的產(chǎn)量，還可以達(dá)到107個(gè)細(xì)胞/ ml高密度培養(yǎng)。

4 其他細(xì)胞

DuckCelt-T17細(xì)胞系來(lái)自原代胚胎鴨細(xì)胞，具有鴨端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（dTERT）的組成型表達(dá)。Emma等人[14]研究表明T17細(xì)胞系是流感疫苗生產(chǎn)的一種選擇，并且在禽類菌株的生產(chǎn)中可能有重大突破。該細(xì)胞可以復(fù)制H5N1和H7N1禽類菌株并達(dá)到107.5IVP / ml的滴度，且能在無(wú)血清分批懸浮培養(yǎng)的條件下生長(zhǎng)至6.5×106細(xì)胞/ml。

CAP細(xì)胞系源自人羊膜細(xì)胞，該細(xì)胞可以用腺病毒（E1A，E1B和pIX）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，隨后在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。Yvonne等人[15]研究發(fā)現(xiàn)CAP細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)不同流感病毒株的高病毒產(chǎn)率，對(duì)于豬和部分人類菌株可以在沒(méi)有進(jìn)一步優(yōu)化的情況下HA滴度高于2.0log10HA單位 /100μl。

Tessa等人[16]研究發(fā)現(xiàn)蝙蝠肺上皮細(xì)胞（TB1-Lu）比MDCK細(xì)胞對(duì)常規(guī)流感病毒具有更大的抗性，而且感染流感病毒的蝙蝠細(xì)胞比MDCK細(xì)胞更有活力。盡管人們猜測(cè)蝙蝠可能是傳統(tǒng)流感病毒的潛在宿主，但很少有研究檢測(cè)過(guò)流感病毒和蝙蝠之間的感染關(guān)系。

除此之外，來(lái)自鴨視網(wǎng)膜細(xì)胞AGE1.CR和AGE1.CR.pIX細(xì)胞系[17]、永生化雞胚細(xì)胞系PBS-1[18]、豬肺上皮細(xì)胞系SJPL[19]、禽胚胎干細(xì)胞系EB66（鴨）[20]已成功測(cè)試流感疫苗的生產(chǎn)，但關(guān)于這些細(xì)胞系生產(chǎn)疫苗的相關(guān)文獻(xiàn)還很少，很可能是因?yàn)樯a(chǎn)過(guò)程仍處于開(kāi)發(fā)階段。=

5 展望

利用細(xì)胞基質(zhì)代替雞胚來(lái)生產(chǎn)流感疫苗的方法就是先培養(yǎng)細(xì)胞，病毒在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中大量繁殖，然后收獲生產(chǎn)疫苗。目前，研究人員已廣泛利用細(xì)胞系如MDCK或Vero進(jìn)行流感疫苗的開(kāi)發(fā)，也有許多臨床試驗(yàn)結(jié)果表明基于細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒疫苗具有安全性的和高免疫原性，因此應(yīng)該鼓勵(lì)更多的疫苗生產(chǎn)企業(yè)用更好的生產(chǎn)技術(shù)來(lái)代替雞胚疫苗。利用細(xì)胞基質(zhì)來(lái)生產(chǎn)流感疫苗可能是未來(lái)疫苗生產(chǎn)的趨勢(shì)，并且隨著與野生流感病毒的更緊密匹配，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)還提供了由所得疫苗引發(fā)更好的免疫原性應(yīng)答的期望。

現(xiàn)在面臨的挑戰(zhàn)是在生產(chǎn)高質(zhì)量疫苗的基礎(chǔ)上以智能方式生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)的疫苗，而且生產(chǎn)過(guò)程中新的細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)該在大流行爆發(fā)時(shí)迅速作出反應(yīng)，縮短病毒種子批次的產(chǎn)量和疫苗供應(yīng)前的時(shí)間。除此之外，低病毒滴度是流感疫苗生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵瓶頸之一，并且為了應(yīng)對(duì)當(dāng)前以及新出現(xiàn)或再次出現(xiàn)的傳染病相關(guān)的疫苗需求，還應(yīng)為疫苗生產(chǎn)提供多種細(xì)胞基質(zhì)。