楊 楠 聶江力 辛 微 夏 徐 郎玉潔 裴 毅

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384)

知母(Anemarrhenaasphodeloides)為百合科(Liliaceae)知母屬(Anemarrhena)多年生草本植物，其干燥根莖可入藥，有清熱瀉火，生津潤(rùn)燥的藥用功效[1]。知母中含有皂苷類、雙苯吡酮類等多種有效成分，在抗老年性癡呆，研究抗癌藥物或先導(dǎo)化合物等方面具有較高的研究?jī)r(jià)值和良好的開發(fā)前景[2]。知母的耐鹽堿能力較強(qiáng)，目前在天津也已經(jīng)試種成功，但知母植株較高，種植凌亂，且品種混亂，質(zhì)量較差，產(chǎn)量較低，所以需要在原有種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上選育性狀更加優(yōu)良的新品種。

誘變可使植物形成自然界沒有的或常規(guī)方法較難獲得的新性狀和新基因，同時(shí)還避免了轉(zhuǎn)基因在安全和后代穩(wěn)定性上的問題。在眾多化學(xué)誘變?cè)噭┲?，甲基磺酸乙?ethyl methane sulfonate，EMS)是目前作物誘變育種中應(yīng)用最廣泛、效果最好的化學(xué)誘變劑之一[3～4]。其原因是利用EMS誘變技術(shù)創(chuàng)制突變體，容易形成點(diǎn)突變，但又不會(huì)造成染色體畸變[5]。我國(guó)化學(xué)誘變育種起步較早，已經(jīng)取得了令世人矚目的成就，誘變育成的品種數(shù)量和種植面積也居世界第一[6]。目前，很多學(xué)者在水稻[7]、擬南芥[8]、大麻[9]和西葫蘆[10]等植物上做了深入的EMS誘變技術(shù)的研究，陳紹江等[11]利用EMS誘變處理玉米花粉，獲得了玉米的高油突變體。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于知母的研究主要集中在其活性成分和藥用效果，針對(duì)優(yōu)良知母品系的誘變育種的研究較少。有學(xué)者利用我國(guó)發(fā)射的神舟三號(hào)宇宙飛船搭載知母種子進(jìn)行航天誘變，回收繁殖后發(fā)現(xiàn)知母中的微量元素指標(biāo)明顯優(yōu)化[12]，但航天誘變不易普及。因此，本試驗(yàn)用不同濃度EMS處理知母種子，確定知母種子誘變的適宜EMS濃度和處理時(shí)間，為創(chuàng)新種質(zhì)資源、選育知母新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

知母(A.asphodeloides)種子采收自天津市薊州區(qū)翠屏湖科學(xué)園中藥種植基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理與發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

選取完整、飽滿的知母種子，用高錳酸鉀溶液浸泡30 min進(jìn)行消毒除菌。EMS溶液用0.01 mol·L-1(pH=7.0)的磷酸緩沖液配制，設(shè)置5個(gè)濃度(V/V)，分別是0%、1%、2%、4%、6%，每個(gè)濃度分別浸種6、8、12、24 h，每組處理3次重復(fù)，處理后的種子用流水沖洗2 h，然后置鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

1.2.2 發(fā)芽指標(biāo)與數(shù)據(jù)處理

計(jì)算發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)致死率等指標(biāo)，各指標(biāo)計(jì)算方法如下：

發(fā)芽率(%)=9d內(nèi)正常萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100%

(1)

相對(duì)發(fā)芽率(%)=各EMS濃度誘變處理組的發(fā)芽率/對(duì)照組的發(fā)芽率×100%

(2)

相對(duì)致死率(%)=(對(duì)照組發(fā)芽率-各處理組的發(fā)芽率)/對(duì)照組的發(fā)芽率×100%

(3)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，用SPSS22.0對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度EMS誘變處理6 h對(duì)知母種子萌發(fā)的影響

不同EMS濃度誘變處理知母種子6 h后置恒溫培養(yǎng)箱發(fā)芽第9天的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)致死率見表1。隨著EMS濃度的增加，知母種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)，相對(duì)致死率逐漸上升。濃度2%處理下，第9天的發(fā)芽率57.8%，相對(duì)發(fā)芽率85.2%，低于對(duì)照組，4%濃度EMS誘變處理組發(fā)芽率54.4%，顯著低于對(duì)照組，6%濃度EMS誘變處理組發(fā)芽率為48.9%，低于對(duì)照組，差異極顯著。

表1不同濃度EMS誘變處理6h對(duì)知母種子萌發(fā)的影響

Table1EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor6honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS濃度EMS concentration(%)發(fā)芽率Germination rate(%)相對(duì)發(fā)芽率Relative germination rate(%)相對(duì)致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.01abAB1000170.0±3.33aA103.3-3.30257.8±3.85bcAB85.214.75454.4±3.85cBC80.319.67648.9±7.69cC72.127.87

由圖1可知，不同濃度EMS誘變處理6 h的知母種子從第2天開始有發(fā)芽，對(duì)照組第5天的發(fā)芽率為47.8%，濃度2%、4%、6%誘變處理組第5天的發(fā)芽率分別為41.1%、38.9%、41.1%。對(duì)照組在第5天后，日發(fā)芽數(shù)逐漸減少，第7天后不再新增發(fā)芽。除濃度1%處理組在第9天發(fā)芽率高于對(duì)照組之外，其余處理組在第5天之后的發(fā)芽率均低于對(duì)照組。

2.2 不同濃度EMS誘變處理8 h對(duì)知母種子萌發(fā)的影響

不同EMS濃度誘變處理知母種子8 h后，置恒溫培養(yǎng)箱發(fā)芽試驗(yàn)。隨著EMS濃度的增加，知母種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率逐漸降低，相對(duì)致死率逐漸升高(表2)。2%濃度EMS誘變處理組在第9天的發(fā)芽率54.4%，相對(duì)發(fā)芽率80.3%，低于對(duì)照組；4%濃度EMS誘變處理組發(fā)芽率為53.3%，顯著低于對(duì)照組，6%濃度EMS誘變處理組發(fā)芽率為44.4%，低于對(duì)照組，差異顯著。

表2不同濃度EMS誘變處理8h對(duì)知母種子萌發(fā)的影響

Table2EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor8honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS濃度EMS concentration(%)發(fā)芽率Germination rate(%)相對(duì)發(fā)芽率Relative germination rate(%)相對(duì)致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.0aA1000157.8±13.5abA85.214.8254.4±11.7abA80.319.7453.3±8.8abA78.721.341644.4±10.7bA65.634.4

由圖2可知，1%和4%濃度處理在第2天開始發(fā)芽，2%、6%和對(duì)照組在第3天開始發(fā)芽，對(duì)照組在第5天的發(fā)芽率為42.2%，濃度2%、4%、6%誘變處理組第5天的發(fā)芽率分別為33.3%、31.1%、23.3%。對(duì)照組和各處理組在第5天日發(fā)芽數(shù)最高，第5天后，日發(fā)芽數(shù)逐漸減少，第7天后不再新增發(fā)芽。各處理組在第5天之后的發(fā)芽率均低于對(duì)照組。

圖2 不同濃度EMS處理知母種子8 h后種子累計(jì)發(fā)芽曲線Fig.2 Cumulative germination curve of A.asphodeloides seed after 8 h treatment with different concentrations of EMS

2.3 不同濃度EMS誘變處理12 h對(duì)知母種子萌發(fā)的影響

不同EMS濃度誘變處理知母種子12 h，置恒溫培養(yǎng)箱發(fā)芽第9天的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)致死率見表3。隨著EMS濃度的增加，知母種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率逐漸降低，相對(duì)致死率逐漸上升。2%濃度EMS誘變處理組在第9天的發(fā)芽率56.7%，相對(duì)發(fā)芽率83.6%，低于對(duì)照組；4%濃度EMS誘變處理組發(fā)芽率為52.2%，低于對(duì)照組，差異顯著；6%濃度EMS誘變處理組發(fā)芽率為36.7%，低于對(duì)照組，差異極顯著。

由圖3可知，對(duì)照組和6%濃度處理在第2天開始發(fā)芽，1%、2%、4%濃度處理組在第3天開始發(fā)芽，對(duì)照組在第5天的發(fā)芽率為55.6%，濃度2%、4%、6%誘變處理組第5天的發(fā)芽率分別為32.2%、26.7%、23.3%。對(duì)照組和各處理組在第5天日發(fā)芽數(shù)最高，第5天后，日發(fā)芽數(shù)逐漸減少，第7天后不再新增發(fā)芽。各處理組在第5天之后的發(fā)芽率均低于對(duì)照組。

表3不同濃度EMS誘變處理12h對(duì)知母種子萌發(fā)的影響

Table3EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor12honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS濃度EMS concentration(%)發(fā)芽率Germination rate(%)相對(duì)發(fā)芽率Relative germination rate(%)相對(duì)致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.0aA1000163.3±5.8abA93.46.6256.7±3.3abAB83.616.4452.2±4.0bAB77.023.0636.7±8.8cB54.145.9

圖3 不同濃度EMS處理知母種子12 h后種子累計(jì)發(fā)芽曲線Fig.3 Cumulative germination curve of A.asphodeloides seed after 12 h treatment with different concentrations of EMS

2.4 不同濃度EMS誘變處理24 h對(duì)知母種子萌發(fā)的影響

不同EMS濃度誘變處理知母種子24 h，置恒溫培養(yǎng)箱發(fā)芽第9天的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)致死率見表4。隨著EMS濃度的增加，知母種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率逐漸降低，相對(duì)致死率逐漸上升。2%濃度EMS誘變處理組在第9天的發(fā)芽率61.1%，相對(duì)發(fā)芽率90.2%，低于對(duì)照組；4%濃度EMS誘變處理組發(fā)芽率為44.4%，低于對(duì)照組，差異極顯著；6%濃度EMS誘變處理組發(fā)芽率為38.9%，低于對(duì)照組，差異極顯著。

表4不同濃度EMS誘變處理24h對(duì)知母種子萌發(fā)的影響

Table4EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor24honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS濃度EMS concentration(%)發(fā)芽率Germination rate(%)相對(duì)發(fā)芽率Relative germination rate(%)相對(duì)致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.0aA1000161.1±2.9aAB90.29.8261.1±5.9aAB90.29.8444.4±2.2bBC65.634.4638.9±4.4bC57.442.6

圖4 不同濃度EMS處理知母種子24 h后種子累計(jì)發(fā)芽曲線Fig.4 Cumulative germination curve of A.asphodeloides seed after 24 h treatment with different concentrations of EMS

由圖4可知，不同濃度EMS誘變處理24 h的知母種子從第2天開始有發(fā)芽，對(duì)照組第5天的發(fā)芽率為48.9%，濃度2%、4%、6%誘變處理組第5天的發(fā)芽率分別為45.6%、31.1%、23.3%。對(duì)照組在第5天后，日發(fā)芽數(shù)逐漸減少，第7天后不再新增發(fā)芽。各處理組在第5天之后的發(fā)芽率均低于對(duì)照組。

2.5 不同濃度EMS誘變對(duì)知母種子萌發(fā)的影響

由圖5可見，隨EMS濃度增加，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。當(dāng)處理時(shí)間為6 h時(shí)，發(fā)芽率較高的是1%和對(duì)照組，且1%處理下種子發(fā)芽率高于對(duì)照組，在70%以上，其次是濃度2%、4%和6%處理，發(fā)芽率均在60以下，且與對(duì)照組差異顯著，發(fā)芽率最低的濃度6%處理組(48.67%)較發(fā)芽率最高的1%處理組(70.33%)降低了21.66%。當(dāng)處理時(shí)間為8 h時(shí)，濃度1%處理的發(fā)芽率降低到57.67%，較6 h時(shí)的濃度1%處理發(fā)芽率降低了12.66%。濃度2%、4%和6%處理下的發(fā)芽率也有所降低，但變化幅度較小。當(dāng)處理時(shí)間為12 h時(shí)，濃度1%處理下發(fā)芽率(73.00%)高于對(duì)照組，為所有處理組的最高值。其余濃度處理組的發(fā)芽率均降低。當(dāng)處理時(shí)間為24 h時(shí)，濃度1%處理的發(fā)芽率高于8 h處理，濃度2%處理的發(fā)芽率高于其他處理時(shí)間，濃度6%處理的發(fā)芽率高于12 h處理。

圖5 不同濃度EMS對(duì)知母種子發(fā)芽率的影響Fig.5 The effect of different EMS concentration on germination rate of A.asphodeloides seeds

從表5可知，不同濃度EMS處理對(duì)知母種子發(fā)芽率影響極顯著，P<0.01，處理時(shí)長(zhǎng)則不是影響知母種子萌發(fā)的主體因素，同時(shí)EMS濃度和處理時(shí)長(zhǎng)的交互作用對(duì)知母種子萌發(fā)的影響較小。

表5不同濃度和時(shí)間處理下知母種子發(fā)芽率的方差分析表

Table5VarianceanalysisofgerminationrateofA.asphodeloidesseedsunderdifferentconcentrationsandtimetreatments

來(lái)源Source平方和SSType Ⅲ Sum of Squaresdf均方S2Mean SquareFP濃度Concentration5810.13941452.53512.8690.000 時(shí)間Time557.5113185.8371.6460.190 濃度/時(shí)間Concentration/time1368.84512114.0701.0140.455 誤差Error5869.37152112.873

3 討論

利用化學(xué)誘變育種已在植物研究領(lǐng)域中被廣泛研究和利用，選擇適宜的誘變劑對(duì)于獲得理想性狀是十分重要的。EMS是一種通過直接修飾堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)而改變DNA性質(zhì)的穩(wěn)定、高效的誘變劑[13]，具有誘變效率高、范圍廣、頻率高等優(yōu)點(diǎn)，已在大田作物突變體庫(kù)構(gòu)建和種質(zhì)創(chuàng)新中得到廣泛應(yīng)用[14]。

進(jìn)行誘變育種研究的關(guān)鍵是確定最佳的誘變條件，通常以半致死濃度為最適宜誘變條件[15]。誘變條件的選擇與種子的大小，種皮的透水性等因素相關(guān)。如種子較小的十字花科植物油菜[16]、大白菜[4]的種子的最佳誘變濃度和時(shí)間分別為0.2% 8 h和0.4%～0.6% 4 h，豆科牧草紫花苜蓿種子[17]的最佳誘變濃度為1.6% 8 h。種子的發(fā)芽率是良好的種子活力的測(cè)定指標(biāo)，有學(xué)者設(shè)置4個(gè)EMS濃度(0%，1%，2%，3%，4%)分別處理加工番茄干種子0、6和12 h，結(jié)果表明，4%濃度處理12 h時(shí)，干番茄種子發(fā)芽率接近半致死劑量[18]。本試驗(yàn)將濃度設(shè)置為1%、2%、4%和6%，時(shí)間設(shè)置為6、8、12和24 h，與前人設(shè)置的濃度和時(shí)間有所不同。通過對(duì)知母種子發(fā)芽效果進(jìn)行分析，結(jié)果表明處理時(shí)間為6和8 h時(shí)，知母種子發(fā)芽率隨EMS濃度增加而減小，且4%濃度EMS處理下，發(fā)芽率接近50%，接近半致死劑量；當(dāng)處理時(shí)間為12和24 h，2%和4%濃度處理下發(fā)芽率接近50%，濃度增加到6%時(shí)，發(fā)芽率為36.67%，顯著低于對(duì)照組，表明6%EMS處理對(duì)種子萌發(fā)損傷較大。

4 結(jié)論

知母是一種常用的中藥材，對(duì)人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)有顯著的藥理作用。本研究通過設(shè)定4個(gè)濃度梯度和4個(gè)時(shí)間梯度對(duì)知母種子進(jìn)行處理，結(jié)果表明EMS濃度為4%，處理時(shí)間為12和24 h時(shí)，發(fā)芽率比較接近50%，接近半致死劑量，確定適宜條件是濃度為4%，浸種12和24 h。通過濃度梯度和時(shí)間梯度篩選出用于EMS處理知母種子的最佳濃度和時(shí)間，為后續(xù)構(gòu)建知母誘變?nèi)后w，篩選品質(zhì)優(yōu)化的知母新品種奠定基礎(chǔ)。