劉雄芳 李太強(qiáng) 張 序 李正紅 萬友名 安 靜 劉秀賢 馬 宏

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)是葉下珠科(Phyllanthaceae)葉下珠屬(Phyllanthus)的一種落葉喬木或灌木，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，包括從喜馬拉雅山到斯里蘭卡、馬六甲海峽以及中國南部等廣大地區(qū)[1]。同時(shí)它也是一種重要的食藥同源經(jīng)濟(jì)樹種，已被世界衛(wèi)生組織列為在世界范圍內(nèi)推廣種植的三種保健植物之一[2]。其葉片、莖皮、根和果實(shí)因含有多種藥用成分如維生素C、鞣質(zhì)、羽扇豆醇、沒食子酸、余甘子酚和超氧化物歧化酶等而被許多少數(shù)民族作為日常用藥，多種治療功效在現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究中也已被證實(shí)[3～5]。其木材常被作為建筑、農(nóng)具和家具用材，又是優(yōu)良的薪炭柴[6]。20世紀(jì)80年代以來，由于不合理的開發(fā)利用，我國余甘子野生資源銳減，自然生境破碎化嚴(yán)重，至今很難見到林相整齊的野生余甘子林[2]。為了有效保護(hù)和合理開發(fā)利用這一兼具重要食用、藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的野生植物資源，亟需對其遺傳多樣性進(jìn)行研究。

遺傳多樣性是生物適應(yīng)多變環(huán)境的基礎(chǔ)，對物種的合理利用和保護(hù)有賴于了解其遺傳多樣性的分布、分化及影響因素[7]。微衛(wèi)星(microsatellite or simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記被用于余甘子遺傳多樣性研究中，為制定余甘子遺傳資源保護(hù)策略具有重要參考價(jià)值。Pandey和Changtragoon[6]利用開發(fā)的6個(gè)SSR標(biāo)記分析了泰國兩個(gè)余甘子居群的遺傳結(jié)構(gòu)并進(jìn)行了種源鑒定，為制定有效的就地保護(hù)和異地保護(hù)方法提供了重要依據(jù)。Mawalagedera等[8]利用SSR標(biāo)記對斯里蘭卡三個(gè)不同地區(qū)余甘子種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析并鑒定出與果實(shí)大小等性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，為保護(hù)和培育遺傳優(yōu)勢品種奠定了基礎(chǔ)。但目前余甘子中可利用的SSR標(biāo)記僅有6個(gè)，大大限制了其在余甘子種質(zhì)資源評價(jià)中的應(yīng)用。鑒于此，本研究利用Illumina Hiseq 4000平臺，對余甘子葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，從獲得的Unigenes序列中對SSR位點(diǎn)進(jìn)行搜索，并對其分布特征、堿基組成和變異規(guī)律進(jìn)行分析，以期為下一步大量EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)提供遺傳學(xué)資料，進(jìn)而為余甘子遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究奠定基礎(chǔ)，亦為余甘子野生資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以云南省賓川縣(25°45′59″N,100°26′29″E)野生余甘子為研究對象，于2017年6月采集余甘子植株的幼嫩葉片，立即置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序及拼接組裝

余甘子總RNA的提取參照Kumar and Singh[9]的方法，質(zhì)檢合格后使用Illumina HiSeq 4000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序完成后先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，然后使用Trinity軟件進(jìn)行de novo組裝，最后使用CD-HIT進(jìn)行聚類得到最終的Unigenes。

1.3 SSR位點(diǎn)的搜索與統(tǒng)計(jì)分析

使用軟件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對余甘子轉(zhuǎn)錄組的所有Unigenes進(jìn)行搜索，查找Unigenes中潛在的1～6 bp的SSR位點(diǎn)，配置參數(shù)為：單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基的最小重復(fù)數(shù)分別為12、6、5、4、4、4，復(fù)合型SSR間隔在100 bp之內(nèi)。采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)余甘子SSR位點(diǎn)的數(shù)量、出現(xiàn)頻率、分布的平均距離、重復(fù)單元類型和比例、重復(fù)單元堿基組成、基元重復(fù)次數(shù)以及序列長度變異等，并結(jié)合SSR和CDS的在Unigenes上的位置信息統(tǒng)計(jì)SSR在編碼區(qū)的分布，全面了解余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR的序列特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 余甘子轉(zhuǎn)錄組測序組裝結(jié)果及統(tǒng)計(jì)

測序共產(chǎn)生10.95 Gb的Raw reads，過濾后獲得10.52 Gb的Clean reads，Q20為98.47%，GC含量為43.29%，所得序列的數(shù)量、質(zhì)量和精確性均較高。通過De novo組裝共獲得97 628條轉(zhuǎn)錄本；進(jìn)一步聚類去冗余得到76 881條Unigenes，總長度為54 842 061 bp，平均長度為713 bp(表1)。

表1余甘子轉(zhuǎn)錄組測序組裝結(jié)果

Table1AssemblysequencingresultsoftranscriptomeofP.emblica

總數(shù)Total總長Total length(bp)N50長度N50 length(bp)平均長度Mean length(bp)轉(zhuǎn)錄本Transcripts97628632988431116648非冗余的Contig unigenes76881548420611257713

2.2 余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的數(shù)量和分布特征

利用MISA軟件在余甘子轉(zhuǎn)錄組76 881條Unigenes中搜索1～6 bp的SSR位點(diǎn)，共獲得9 991個(gè)SSR，位于9 538條Unigenes上，其中包含454個(gè)復(fù)合型SSR，含有1個(gè)以上SSR的Unigenes有680條。SSR的發(fā)生頻率(含有SSR位點(diǎn)的Unigenes占Unigenes總數(shù)的百分比)為12.41%，包含SSR的一致序列出現(xiàn)頻率(所得SSR總數(shù)占Unigenes總數(shù)的百分比)為13.00%；SSR的分布密度為0.182 SSRs/kB，平均每5.49 kB出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)；搜索到的SSR序列拼接總長度為180 175 bp，占整個(gè)余甘子轉(zhuǎn)錄組序列的0.33%(表2)。

表2 余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR各重復(fù)類型的分布特征

圖1 余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR不同重復(fù)類型各基元的比例 Others表示未列出的其余基元的統(tǒng)稱Fig.1 Motif proportions of each types of repeat in P.emblica transcriptome Others:the rest of all repeat motifs unlisted in the bar.

進(jìn)一步分析可知(表2)，在獲得的余甘子轉(zhuǎn)錄組所有SSR中，以單堿基重復(fù)類型最多，達(dá)4 226個(gè)，占總數(shù)的42.30%；其次是二堿基和三堿基重復(fù)類型，分別占30.79%和19.75%；四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)類型所占比例均較低且呈遞減趨勢。若單堿基重復(fù)類型不予考慮，余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR主要集中分布在二、三堿基重復(fù)類型上，兩者總量占單堿基重復(fù)外的總SSR數(shù)量的87.58%。另外，各重復(fù)單元類型的出現(xiàn)頻率、平均距離及分布密度變化也較大。其中，出現(xiàn)頻率、分布密度與SSR含量變化規(guī)律一致，表現(xiàn)為：單堿基>二堿基>三堿基>四堿基>五堿基>六堿基；與此相反的是，平均距離以六堿基最大，為507.80 kB，以單堿基最小，為12.98 kB，且兩者差異達(dá)39倍，即余甘子轉(zhuǎn)錄組序列中每出現(xiàn)39個(gè)單堿基重復(fù)類型才出現(xiàn)1個(gè)六堿基重復(fù)類型。

2.3 余甘子轉(zhuǎn)錄組中SSR在編碼區(qū)中的分布特征

在余甘子轉(zhuǎn)錄組的42 953條CDS(編碼區(qū))所在Unigenes中共發(fā)現(xiàn)6 535個(gè)SSR位點(diǎn)，其中位于編碼區(qū)的SSR位點(diǎn)僅有1 731個(gè)，而位于非編碼區(qū)的位點(diǎn)有4 563個(gè)，另外還有241個(gè)位點(diǎn)跨越了編碼區(qū)和非編碼區(qū)。余甘子轉(zhuǎn)錄組編碼區(qū)SSR的出現(xiàn)頻率(編碼區(qū)SSR個(gè)數(shù)與CDS總長度之比)為0.039 SSRs/kB，而在非編碼區(qū)SSR出現(xiàn)頻率為0.103 SSRs/kB，說明非編碼區(qū)SSR的出現(xiàn)頻率大約是編碼區(qū)的2.6倍。在基因編碼區(qū)中，所占比例最高的是三堿基重復(fù)(788，45.52%)，其次是單堿基重復(fù)(460，26.57%)和二堿基重復(fù)(289，16.70%)；而在非編碼區(qū)以單堿基重復(fù)為主(1 928，42.25%)，其次是二堿基重復(fù)(1 463，32.06%)。

2.4 余甘子轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)基元堿基組成

在考慮到堿基互補(bǔ)的情況下，余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR中共有169種重復(fù)基元，其中單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)基元數(shù)分別為2、4、10、31、56和66種。不同重復(fù)類型各基元所占比例差異較大(圖1)，其中單堿基重復(fù)類型中以A/T基元占優(yōu)勢，占該類型的99.53%；二堿基重復(fù)類型中各基元所占比例依次為：AG/CT(74.42%)>AT/AT(14.56%)>AC/GT(10.92%)>CG/CG(0.10%)；三堿基重復(fù)類型中以AAG/CTT最多(26.35%)，其次是ATC/GAT(13.38%)、AGG/CCT(13.28%)和ACC/GGT(11.86%)；四堿基重復(fù)類型中AAAG/CTTT和AAAT/ATTT基元所占比例較高，分別為23.45%和22.60%；五堿基、六堿基重復(fù)類型中較多的基元分別是AAAAG/CTTTT(11.81%)和AAAAAT/ATTTTT(7.41%)。

整體來看，在余甘子轉(zhuǎn)錄組的169種重復(fù)基元中，出現(xiàn)頻率最高的前5種分別是A/T、AG/CT、AAG/CTT、AT/AT和AC/GT，分別占SSR總數(shù)的42.10%、22.91%、5.02%、4.48%和3.36%。另外，在植物轉(zhuǎn)錄組中較少出現(xiàn)的CG/CG基元在余甘子轉(zhuǎn)錄組中有3個(gè)，在大多數(shù)單子葉植物中較常見而在雙子葉植物中很少見的CCG/CGG基元在余甘子轉(zhuǎn)錄組中有83個(gè)。

2.5 余甘子轉(zhuǎn)錄組中SSR基元重復(fù)次數(shù)

余甘子轉(zhuǎn)錄組中SSR各重復(fù)類型的重復(fù)次數(shù)變化范圍介于4～75次，且多數(shù)集中于4～20次，總體表現(xiàn)為重復(fù)次數(shù)隨著各重復(fù)單元堿基數(shù)的增加而減少，其中單堿基重復(fù)12～75次，二堿基重復(fù)6～36次，三堿基重復(fù)5～26次，四堿基重復(fù)4～12次，五、六堿基均重復(fù)4～6次?？傮w來看，SSR的重復(fù)次數(shù)以4～10次居多(51.95%)，11～20次的占45.36%，重復(fù)次數(shù)大于20次的SSR僅占2.69%，表現(xiàn)為隨著重復(fù)次數(shù)的增加SSR出現(xiàn)的頻率降低(圖2)。

圖2 余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR各重復(fù)類型不同重復(fù)次數(shù)分布頻率Fig.2 Percentage of various repeat types with different number of repeats in P.emblica transcriptome

2.6 余甘子轉(zhuǎn)錄組中SSR序列長度分布

余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)片段長度波動于12～78 bp，平均長度為16.77 bp，正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示不符合正態(tài)分布(Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)結(jié)果P=0.00<0.05，峰度(Ku)=5.87>0，偏度(Sk)=45.96>0)。在各重復(fù)類型中，單堿基重復(fù)和三堿基重復(fù)長度變化范圍較大，分別為12～75和15～78 bp，其次是二堿基重復(fù)(12～72 bp)；在各重復(fù)基元中，以(A/T)n基元長度變化范圍最大(12～75 bp)，其次是(AG/CT)n(12～72 bp)和(AAG/CTT)n(15～72 bp)。單、二、三、四、五、六堿基重復(fù)的平均長度分別為14.61、17.69、18.72、17.66、21.57和24.87 bp(表2)，除四堿基重復(fù)長度略有降低外，各重復(fù)類型長度變化表現(xiàn)出片段的平均長度隨重復(fù)類型堿基數(shù)的增加而增加的趨勢；而且各堿基重復(fù)類型均表現(xiàn)為SSR出現(xiàn)頻率隨各堿基重復(fù)區(qū)段片段長度的增加而降低，即重復(fù)區(qū)段堿基片段長的，對應(yīng)的SSR數(shù)量較少。在全部堿基中，長度為12 bp的SSR在余甘子轉(zhuǎn)錄組中所占比例最高，為20.78%，其次是15 bp(14.69%)、14 bp(11.47%)和16 bp(10.32%)，有21.20%的重復(fù)區(qū)段片段長度≥20 bp，且以低級重復(fù)類型為主(74.43%)，而重復(fù)區(qū)段片段長度≥30 bp的僅占8.95%(圖3)。

圖3 余甘子轉(zhuǎn)錄組中SSR的長度分布Fig.3 Length distribution of SSR in P.emblica transcriptome

對余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR不同重復(fù)類型長度變異情況進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析可知(圖4)，單堿基重復(fù)類型的長度變異程度最高，有43種不同長度，其次是二堿基重復(fù)類型，有28種；三堿基、四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)類型片段長度的變異程度依次降低，其中五、六堿基均只有3種變化長度。通過SPSS軟件對余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)片段長度與出現(xiàn)頻率進(jìn)行Person相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者在0.01水平上顯著負(fù)相關(guān)(P=0.00<0.01)，相關(guān)系數(shù)為-0.561，具有中等程度相關(guān)性。

3 討論

本研究利用MISA軟件對余甘子葉片轉(zhuǎn)錄組測序組裝得到的76 881條Unigenes進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找與分析，共搜索到9 991個(gè)SSR位點(diǎn)，涵蓋了從單堿基重復(fù)到六堿基重復(fù)類型以及復(fù)合型SSR共7種類型，SSR的發(fā)生頻率為12.41%，包含SSR一致序列出現(xiàn)頻率為13.00%，SSR的分布密度為0.182 SSRs/kB，平均每5.49 kB出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR的分布密度與大多數(shù)雙子葉植物如短絲木犀(Osmanthusserrulatus)(0.183 SSRs/kB)[10]、文冠果(Xanthocerassorbifolia)(0.186 SSRs/kB)[11]和青檀(Pteroceltistatarinowii)[12](0.189 SSRs/kB)等相近，而低于擬南芥(Arabidopsisthaliana)(0.357 SSRs/kB)、高粱(Sorghumbicolor) (0.646 SSRs/kB)和水稻(Oryzasativa)(0.739 SSRs/kB)等單子葉植物[13]，這可能是由于物種之間的趨異進(jìn)化使得雙子葉植物SSR分布密度偏低[14]，也有可能與不同物種之間SSR所在基因的表達(dá)豐度、SSR序列的搜索來源、搜索軟件及設(shè)定的參數(shù)不同有關(guān)。

圖4 余甘子轉(zhuǎn)錄組不同長度重復(fù)單元SSR長度變異情況 餅圖每一扇區(qū)對應(yīng)不同長度的SSR標(biāo)注于所占比例上部括號內(nèi)，若對應(yīng)長度SSR頻率≤1%，則一起合并在黑色扇區(qū)內(nèi)。Fig.4 Length diversification of SSR in P.emblica transcriptome SSR in different lengths are demonstrated in separate slices. If the corresponding percentage≤1%,slices were combined for percentages(black slices).

在所獲得的余甘子轉(zhuǎn)錄組所有SSR中，優(yōu)勢重復(fù)類型為單堿基重復(fù)，占42.30%，其次為二堿基重復(fù)(30.79%)和三堿基重復(fù)(19.75%)。通常認(rèn)為，低級重復(fù)單元的大量存在暗示著該物種進(jìn)化水平較高，而高級重復(fù)單元出現(xiàn)頻率高的物種具有較短的進(jìn)化時(shí)間和較低的變異頻率[15～16]。余甘子單堿基、二堿基和三堿基重復(fù)類型占全部堿基重復(fù)類型的92.84%，可能預(yù)示著這一物種進(jìn)化時(shí)間較長或變異頻率較高。而在余甘子基因編碼區(qū)中，主要重復(fù)類型為三堿基重復(fù)，占編碼區(qū)SSR總數(shù)的45.52%，比例超過單堿基重復(fù)(26.57%)和二堿基重復(fù)(16.70%)，表現(xiàn)出較高的富集水平。這可能是密碼子選擇作用的結(jié)果，與其它幾種重復(fù)類型相比，三堿基重復(fù)次數(shù)的變化一般不改變基因讀碼框，使得其在編碼區(qū)序列中的容受性較好，對基因表達(dá)產(chǎn)物的影響較小，進(jìn)而有利于物種的生存和延續(xù)，這也說明SSR三堿基重復(fù)類型的富集是基因編碼區(qū)SSR在基因組中得以保存的重要機(jī)制，因此在生物長期選擇過程中，三堿基重復(fù)類型更易在基因編碼區(qū)中發(fā)生富集[17～18]。大量三堿基重復(fù)SSR的富集對生物體來說具有重要的生物學(xué)意義，如在人類基因組的研究中發(fā)現(xiàn)三堿基重復(fù)SSR與某些疾病的發(fā)生相關(guān)[19]；將余甘子轉(zhuǎn)錄組獲得的所有Unigenes比對到KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)了203條與人類疾病相關(guān)的Unigenes，并且利用PRGdb數(shù)據(jù)庫預(yù)測到3 806條編碼抗性基因的Unigenes，這些是否與余甘子基因編碼區(qū)出現(xiàn)大量的三堿基重復(fù)有關(guān)，對余甘子生長發(fā)育和抗逆性有何意義，還有待進(jìn)一步深入研究。

不同重復(fù)類型中各重復(fù)基元所占比例不盡相同。在余甘子轉(zhuǎn)錄組單堿基重復(fù)類型中以A/T重復(fù)基元為主，在其它重復(fù)類型中AT出現(xiàn)頻率也較高，二至六堿基重復(fù)類型中AT/AT、AAT/ATT、AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT和AAATT/AATTT以及AAAAAT/ATTTTT基元含量也相對較高，表現(xiàn)出一定的AT優(yōu)勢，這種趨勢可能與堿基所含的能量有關(guān)[20]。但是在主要重復(fù)類型二、三堿基重復(fù)類型中分別以AG/CT和AAG/CTT居多，分別占SSR總數(shù)的22.91%和5.02%，與碧桃(Prunuspersicacv.duplex)[21]、棗(Ziziphusjujuba)[22]、長梗杜鵑(Rhododendronlongipedicellatum)[16]等植物轉(zhuǎn)錄組SSR的研究結(jié)果一致。在余甘子轉(zhuǎn)錄組三堿基重復(fù)類型中，AAG/CTT、ATC/GAT和AGG/CCT所占比例最高，與Blanca等[23]和李炎林等[24]分別報(bào)道的西葫蘆(Cucurbitapepo)和紅豆杉(Taxuschinensis)轉(zhuǎn)錄組SSR三堿基重復(fù)類型中的優(yōu)勢基元AAG、AGC、ATC和AGG相似，對多個(gè)樹種的統(tǒng)計(jì)也表明三堿基重復(fù)類型中AAG、AGC和AGG較多[25]，這些重復(fù)基元可能普遍存在于EST序列中，也可能是在大多數(shù)植物中的優(yōu)勢蛋白或DNA家族[26]。有研究表明GC重復(fù)基元可能與植物的某些特定功能有關(guān)，如植物的抗逆性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[27～28]，在余甘子轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了一定量的GC，如單堿基重復(fù)中的G/C、二堿基重復(fù)中的CG/CG、三堿基中的AGC/GCT、CCG/CGG等，這些重復(fù)基元在余甘子的生命活動中是否具有特定功能還需要進(jìn)一步研究。但是在余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR中的GC含量很少，有研究認(rèn)為GC重復(fù)基元少是因?yàn)榛蚪MDNA中的CpG甲基化導(dǎo)致堿基C易突變?yōu)門，但較少的GC含量可維持DNA的穩(wěn)定性[29]，這些將為余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR引物的開發(fā)提供重要的啟示。

SSR的多態(tài)性是判斷其是否可用于分子標(biāo)記開發(fā)研究的重要依據(jù)，而SSR重復(fù)次數(shù)和序列長度又是影響其多態(tài)性高低的重要因素，這種多態(tài)性被認(rèn)為是由復(fù)制過程中的滑動引起的[30]。SSR重復(fù)單元長度越長，所受選擇壓力將會越大，則拷貝數(shù)(重復(fù)次數(shù))越少，因此重復(fù)單元堿基數(shù)較少的SSR變異速率較快，重復(fù)單元堿基數(shù)較多的變異速率較慢，相對較穩(wěn)定[31]；而SSR重復(fù)次數(shù)越多，變異性越大，其多態(tài)性潛力就越高[32]，特別是當(dāng)重復(fù)次數(shù)達(dá)到12次以上時(shí)，SSR引物表現(xiàn)出較高多態(tài)性[33]。本研究發(fā)現(xiàn)余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)波動于4～75次，且多數(shù)集中于4～20次，且表現(xiàn)為重復(fù)次數(shù)隨各重復(fù)單元堿基數(shù)的增加而減少(其中單堿基容易發(fā)生錯(cuò)配不考慮在內(nèi))。結(jié)合上述兩種觀點(diǎn)可知，余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR中的二、三堿基重復(fù)類型的變異性較大，多態(tài)性潛力較高，而且在我們前期開展的余甘子20對EST-SSR標(biāo)記開發(fā)研究中已經(jīng)證實(shí)了這一點(diǎn)[34]，在今后SSR標(biāo)記大規(guī)模開發(fā)研究中應(yīng)優(yōu)先考慮這兩種類型。從SSR序列長度來看，長度≥20 bp時(shí)多態(tài)性較高，長度于12～20 bp時(shí)具中等程度多態(tài)性，長度<12 bp時(shí)多態(tài)性極低[35]；本研究在SSR篩選過程中已過濾掉12 bp以下的SSR，最終發(fā)現(xiàn)余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR序列長度變化范圍在12～78 bp，平均長度為16.77 bp，Person相關(guān)性分析表明余甘子轉(zhuǎn)錄組SSR序列長度與其發(fā)生頻率在0.01水平上呈顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為-0.561)，其中≥20 bp的高多態(tài)SSR占21.20%，其比例高于碧桃(12.13%)[21]、短絲木犀(13.47%)[10]、楊樹(16.63%)[17]等大多數(shù)植物，且當(dāng)≥20 bp時(shí)以低級重復(fù)類型為主(二、三堿基重復(fù)類型占61.00%)，這些高多態(tài)性SSR在余甘子分子標(biāo)記開發(fā)中將具有極大利用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究利用MISA軟件在余甘子轉(zhuǎn)錄組Unigenes中查找SSR序列，共搜索到9 991個(gè)SSR位點(diǎn)，并對其進(jìn)行SSR位點(diǎn)數(shù)量、在轉(zhuǎn)錄組和編碼區(qū)中的分布特征、重復(fù)單元類型、重復(fù)基元堿基組成、重復(fù)次數(shù)及其序列長度分布情況等統(tǒng)計(jì)分析。研究結(jié)果表明余甘子轉(zhuǎn)錄組大多數(shù)SSR位點(diǎn)多態(tài)性潛能較高，用于遺傳多樣性分析的潛力較大，為下一步大規(guī)模開發(fā)余甘子SSR分子標(biāo)記提供了重要的數(shù)據(jù)信息和可靠依據(jù)，尤其是分布于編碼區(qū)的SSR將有助于功能標(biāo)記的開發(fā)，進(jìn)而為余甘子種質(zhì)資源分類與鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究奠定基礎(chǔ)。