顏 斌 武丹陽 李慧玉

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

BrassinolideEnhancedExpression(BEE)基因編碼植物所特有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)控油菜素內(nèi)酯(BR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要元件[1]。目前對該類基因的研究較少。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)3個(gè)BEE基因是BR信號(hào)途徑中是早期應(yīng)答受體，該基因間存在功能冗余，3個(gè)基因同時(shí)突變的擬南芥表現(xiàn)出植株矮小和開花延遲等現(xiàn)象，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該類基因除了參與BR途徑外，還參與其他激素途徑[1]。在楊樹中，BEE3基因通過增加木質(zhì)部細(xì)胞的增殖提高楊樹的生物量[2]，除此之外，還發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，BEE和BIM能正調(diào)控光響應(yīng)途徑[3]。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是一類在生物界廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物中廣泛參與生長發(fā)育過程的調(diào)控，以及外界環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[4～6]。水稻中，OsbHLH148參與應(yīng)答茉莉酸、脫落酸以及干旱、高鹽、低溫和機(jī)械損傷等非生物脅迫，并且通過參與茉莉酸信號(hào)途徑對水稻的干旱耐受性起調(diào)節(jié)作用[7]。在擬南芥中，bHLH家族基因BP1、AtMYC2及AtAIB參與了脫水脅迫反應(yīng)[8]。陸地棉中分離的GhbHLH1被ABA、干旱和鹽脅迫所誘導(dǎo)表達(dá)。擬南芥中發(fā)現(xiàn)的bHLH92轉(zhuǎn)錄因子，受鹽、干旱、滲透、冷等多種脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[9～10]。在水稻幼苗中，OsbHLH1基因能特異地被冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá),研究表明，OsbHLH1基因在冷信號(hào)傳導(dǎo)過程中起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用[11]。

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)為樺木科(Betulaceae)樺屬(Betula)植物，是天然林更新先鋒樹種，具有重要的生態(tài)、觀賞和實(shí)用經(jīng)濟(jì)價(jià)值，被列為國家科技計(jì)劃研究的重要樹種之一[12～13]。本研究以白樺為研究對象，克隆BpBEE2全長cDNA序列，構(gòu)建過表達(dá)及抑制表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)BpBEE2基因的過表達(dá)和抑制表達(dá)白樺株系，為揭示BpBEE2基因在植物生長發(fā)育及抗逆性中起到的提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

采自東北林業(yè)大學(xué)林木白樺強(qiáng)化育種基地內(nèi)的白樺全同胞種子，選擇發(fā)育狀態(tài)良好的成熟種子作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。

pBIOZOL Plant Total RNA Extraction Reagent購置于北京博邁斯生物科技有限公司，高保真KOD酶購置于東洋紡(上海)生物科技有限公司，ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡(上海)生物科技有限公司，限制性內(nèi)切酶XalⅠ、BamHⅠ、SacⅠ和KpnⅠ均購自于寶生物工程(大連)有限公司，pENTRTM SD/D-TOPO Cloning Kit(Lot no.650448)with One Shot Chemically CompetentE.coli(K2420)和Gateway LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix(Lot no.635076)購置于Invitrogen公司。感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105菌株、pGWB2和pROKⅡ載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 白樺BpBEE2基因的克隆

利用pBIOZOL Plant Total RNA Extraction Reagent試劑盒提取白樺的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，利用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min后，進(jìn)行PCR循環(huán)：94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后繼續(xù)在72℃延伸7 min，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。使用膠回收試劑盒回收純化目的片段，并送往上海英俊生物公司進(jìn)行測序。

表1構(gòu)建BpBEE2基因植物過表達(dá)載體的引物序列

Table1Primersequencesofbuildingplantoverexpressionvector

引物名稱Primer name引物序列Primer sequences(5′—3′)GBEE2-FCACCATGTTAAATTGTTTGTTAAACTCC GBEE2-RATGAAACCCCACATTATAAGGCC

1.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建

1.3.1BpBEE2植物過表達(dá)載體構(gòu)建

利用GATEWAY技術(shù)構(gòu)建植物過表達(dá)載體[14]，具體方法參見pENTRTM/D-TOPO Cloning Kit和LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix試劑盒說明書。通過PCR及測序鑒定為陽性的克隆(pGWB2-BpBEE2)，提取質(zhì)粒通過電擊法導(dǎo)入EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在LB培養(yǎng)基(50 mg·L-1卡那霉素+50 mg·L-1利福平)上篩選，鑒定含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，作為遺傳轉(zhuǎn)化用的工程菌。

1.3.2BpBEE2植物抑制表達(dá)載體構(gòu)建

植物抑制表達(dá)載體圖譜如圖1所示，根據(jù)此圖譜進(jìn)行載體構(gòu)建。選擇BpBEE2基因3′端的一段201 bp的特異序列，將這段序列的正義鏈(BEE2-1)與反義鏈(BEE2-2)，通過來自細(xì)菌中的一段207 bp的intron連接，形成一個(gè)含有l(wèi)oop的發(fā)夾結(jié)構(gòu)[15]。通過表2引物擴(kuò)增目的片段，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ對BEE2-1片段進(jìn)行酶切；限制性內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ對BEE2-2片段進(jìn)行酶切；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ對intron片段進(jìn)行酶切；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ對pROKⅡ進(jìn)行酶切。將3個(gè)片段通過T4DNA連接酶連接到pROKⅡ載體上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中，通過抗性LB培養(yǎng)基(50 mg·L-1卡那霉素)及PCR篩選獲得陽性單菌落，送往上海英俊生物公司進(jìn)行測序，送測正確的質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)中，PCR驗(yàn)證。

1.4 白樺遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以白樺種子為受體進(jìn)行合子胚遺傳轉(zhuǎn)化，具體方法參見張瑞萍[16]。在選擇培養(yǎng)基中加入卡那霉素進(jìn)行選擇，獲得抗性株系進(jìn)行二次篩選。利用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因及對照白樺總DNA，分別以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測目的基因是否成功導(dǎo)入到植物體內(nèi)。

表2構(gòu)建BpBEE2基因植物抑制表達(dá)載體的引物序列

Table2Primersequencesofbuildingplantinhibitingexpressionvector

引物名稱Primer name引物序列Primer sequences(5′—3′)riBEE2-1GTACTCTAGAGTTTAGCAGAAAGGGCAAGAAGGriBEE2-2GTACGAGCTCGTTTAGCAGAAAGGGCAAGAAGGriBEE2-3GTACGAGCTCGTTTAGCAGAAAGGGCAAGAAGGriBEE2-4GTACGGTACCCAGTGTTGAGTTCTAGCTTCGintron-1GTACGGATCCTAAATTTCTAGTTTTTCTCCintron-2GTACGGTACCCTGTAACTATCATCATCATC

圖1 植物表達(dá)載體pROKⅡ-RNAiBpBEE2的構(gòu)建圖譜Fig.1 Plant expression vector constructs pROKⅡ-RNAiBpBEE2 map

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的生長量測定及抗逆分析

對獲得的1個(gè)超表達(dá)株系(OE-BpBEE2)、2個(gè)抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(RNAi-BpBEE2-1和RNAi-BpBEE2-2)及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗颠M(jìn)行大量擴(kuò)繁，生根后移栽到土中，培養(yǎng)1個(gè)月后，選取每個(gè)株系中長勢一致的株系30株進(jìn)行苗高測定。同時(shí)對各株系長勢一致的繼代苗分別培養(yǎng)在加入0.3% NaCl、0.6% NaCl、5% PEG6000和10% PEG6000的WPM培養(yǎng)基中，每種處理各株系分別選取30株培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d，稱量每株植株的鮮重,計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，使用Prism 6.0進(jìn)行多重分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpBEE2基因的克隆

利用pBIOZOL Plant Total RNA Extraction Reagent試劑盒成功提取白樺葉片的總RNA(圖2A)，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)白樺轉(zhuǎn)錄組獲得的BpBEE2序列[17]設(shè)計(jì)特異引物，以cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中。PCR電泳檢測結(jié)果顯示在1 080 bp處獲得特異條帶(圖2B)。產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司，測序獲得的序列與已知BpBEE2基因序列一致。

圖2 白樺總RNA的提取及BpBEE2基因的克隆鑒定A.白樺總RNA；B.白樺BpBEE2基因的克隆(1.Marker DL2000；2.白樺BpBEE2PCR產(chǎn)物Fig.2 Birch of total RNA extraction and cloning identification of BpBEE2 gene A.Total RNA of B.platyphylla B. BpBEE2 cloning(1.Marker DL2000；2.PCR production of BpBEE2)

2.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建

2.2.1BpBEE2植物過表達(dá)載體構(gòu)建

以pMD18-BpBEE2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行TOPO反應(yīng)，并通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。陽性單克隆PCR檢測后在1 080 bp獲得目的條帶(圖3A)。將TOPO重組質(zhì)粒與pGWB2載體連接進(jìn)行LR反應(yīng)，反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，PCR檢測為陽性單克隆(圖3B)，通過電擊法將pGWB2-BpBEE2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)中，利用特異性引物對獲得的陽性單克隆進(jìn)行PCR檢測，在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(圖3C)。結(jié)果表明，目的基因BpBEE2已成功構(gòu)建到了pGWB2載體上。

圖3 植物過表達(dá)載體構(gòu)建及檢測 A.TOPO反應(yīng)PCR檢測(1.Marker DL2000；2.陰性對照；3.陽性對照；4.試樣) B.LR反應(yīng)PCR檢測(1.Marker DL2000；2.陰性對照；3.陽性對照；4.試樣) C.BpBEE2基因農(nóng)桿菌引物組合PCR檢測(1.Marker DL2000；2.基因引物；3.基因與載體引物；4.載體與基因引物；5.載體引物)Fig.3 Construction and identification of plant overexpression vector of BEE2 A. PCR identification of TOPO reaction(1.Marker DL2000；2.Negative control；3.Positive control；4.Samples) B. PCR identification of LR reaction(1.Marker DL2000；2.Negative control；3.Positive control；4.Samples) C. PCR identification of transformation of A.tumefaciens(1.Marker DL2000；2.Primers from gene；3.Primers from gene and vector；4.Primers from gene and vector；5.Primers from vector)

圖4 植物抑制表達(dá)載體構(gòu)建及檢測 A.BpBEE2基因植物抑制表達(dá)載體部件的PCR擴(kuò)增(1.Marker DL2000；2.Intron；3.BEE2-1；4.BEE2-2) B.BpBEE2抑制表達(dá)載體重質(zhì)粒PCR(1.Marker DL2000；2.水對照；3.陰性對照；4.陽性重組質(zhì)粒)Fig.4 Construction and identification of plant inhibiting expression vector of BEE2 A.PCR of vector fragments(1.Marker DL2000；2.Intron；3.BEE2-1；4.BEE2-2) B.The PCR assay for recombinant plasid(1.Marker DL2000；2.Water control；3.Negative control；4.Recombinant plasid)

2.2.2BpBEE2植物抑制表達(dá)載體構(gòu)建

以pMD18-BpBEE2質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增其3'端201 bp的特異序列，同時(shí)擴(kuò)增細(xì)菌的207 bp intron序列(圖4A)，酶切連接將這3個(gè)片段形成loop結(jié)構(gòu)并連接到在pROKⅡ載體的多克隆位點(diǎn)中。對轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得的單克隆分別以riBEE2-1和riBEE2-3為引物進(jìn)行菌液PCR檢測(圖4B)，結(jié)果顯示在608 bp處獲得特異條帶，并與目標(biāo)條帶大小一致。隨后將構(gòu)建成功的pROKⅡ-RNAiBpBEE2載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105內(nèi)。

2.3 白樺遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測

2.3.1 轉(zhuǎn)BpBEE2基因植株的獲得

用含有pROKⅡ-RNAiBpBEE2的農(nóng)桿菌侵染白樺合子胚，暗培養(yǎng)后對其進(jìn)行脫菌處理，2～3 d后，將合子胚置于選擇培養(yǎng)基上，25 d過后可見切口處長有綠色的愈傷顆粒(圖5A～B)；待愈傷長到直徑5 mm的大小，將其放置分化培養(yǎng)基上，數(shù)日后愈傷組織慢慢形成不定芽(圖5C)；再培養(yǎng)20～30 d，叢生苗生根(圖5D)。最終獲得過表達(dá)株系1個(gè)，命名為OE-BpBEE2-1，抑制表達(dá)株系2個(gè)，分別命名為RNAi-BpBEE2-1、RNAi-BpBEE2-2。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因株系的檢測

以過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株、抑制表達(dá)及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟逯晗等~片DNA作為模板，采用BpBEE2基因上、載體下游引物及riBEE2-1和intron-2為引物分別對過表達(dá)株系及抑制表達(dá)株系進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示目的條帶位置與陽性對照的位置一致(圖6)。證明外源基因已成功轉(zhuǎn)入白樺中。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株的獲得 A.抗性愈傷；B.抗性愈傷分化；C.繼代苗的培養(yǎng)；D.生根苗的培養(yǎng)Fig.5 Regeneration and identification of BpBEE2 transgenic lines A.Resistant calli; B.The differentiation culture containing resistant calli; C.Transgenerational seedling cultivation; D.The cultivation of rooted plantlets

圖6 轉(zhuǎn)基因株系的檢測 A.過表達(dá)株系PCR檢測電泳圖(1.Marker DL2000；2.水對照；3.NT；4.陽性對照；5.轉(zhuǎn)基因株系) B.抑制表達(dá)株系PCR檢測電泳圖(1.Marker DL2000；2.陰性對照；3.NT；4.陽性對照；5～8.抗性株系)Fig.6 PCR amplification analysis of BpBEE2 in transgenic lines A. PCR amplification analysis of overexpression transgenic lines(1.Marker DL2000; 2.Water control; 3.Negative control(untransformed plant); 4.Positive control; 5.Transgenic line) B. PCR amplification analysis of inhibiting expression transgenic lines(1.Marker DL2000; 2.Water control; 3.Positive control; 4.Negative control(untransformed plant); 5-8.Transgenic line

圖7 苗高測定 A～B.移栽后苗高測定；C～D.組培苗苗高測定 ***P<0.001Fig.7 Seedling height of trangenetic lines and nontrangenetic line A-B.Seedling height of transplanting plantlets; C-D.Seedling height of tissue culture plantlets

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的生長量測定及抗逆分析

2.4.1 轉(zhuǎn)基因株系生長量測定

對移栽后的轉(zhuǎn)基因株系和培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生根苗的苗高進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明：在2種基質(zhì)中，轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系的苗高均差異顯著，其中過表達(dá)株系的苗高明顯高于野生型，比對照株系分別提高了44.2%和16.8%(圖7)，而2個(gè)抑制表達(dá)株系的生長量顯著低于野生型，分別比對照株系降低了43.4%和30.5%；53.9%和30.1%(圖7)。

2.4.2 轉(zhuǎn)基因株系鹽、旱脅迫后鮮重變化情況

無處理組中，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ张c過表達(dá)株系鮮重差異不顯著，抑制表達(dá)株系鮮重顯著低于對照株系。NaCl處理后，各株系生長量明顯降低，但過表達(dá)株系的鮮重高于對照及抑制表達(dá)株系。PEG處理后，抑制表達(dá)株系在的鮮重顯著低于對照及過表達(dá)株系(圖8)。這表明，BpBEE2基因可能參與到鹽旱脅迫途徑中。

圖8 轉(zhuǎn)基因株系不同脅迫處理下生長量變化Fig.8 Fresh weights of trangenetic lines and nontrangenetic line under different stress processing **P<0.01；***P<0.001

3 討論

BEE基因是編碼植物所特有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長發(fā)育過程及非生物脅迫反應(yīng)[18]。BpBEE1，BpBEE2和BpBEE3屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子的第25亞類，與擬南芥中AtBEEs同源性較高[17]。已有研究報(bào)道，擬南芥第25亞類中共有17個(gè)成員，其中包括AtBEE1，AtBEE2，AtBEE3和AtCIB1基因，這些基因參與激素信號(hào)途徑和器官的發(fā)育[19]。武丹陽[17]等發(fā)現(xiàn)，在白樺生長旺盛時(shí)期，BpBEE1、BpBEE2、BpBEE3基因在白樺頂芽、葉片等組織部位中均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，因此認(rèn)為白樺BpBEE基因參與了植物的生長發(fā)育過程。本研究克隆了BpBEE2基因的全長序列，并構(gòu)建了過表達(dá)及抑制表達(dá)載體，進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。對獲得的BpBEE2過表達(dá)及抑制表達(dá)株系轉(zhuǎn)基因株系的生長量及抗逆性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系的苗高高于對照株系，而抑制表達(dá)株系的苗高低于對照株系，進(jìn)一步證明了BpBEE2參與了植物的生長發(fā)育過程。許思佳[20～21]等此前已對BpBEE1啟動(dòng)子順式原件進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子中含有一些激素響應(yīng)及脅迫應(yīng)答元件，并證實(shí)BpBEE參與MeJA、SA、BL和ABA應(yīng)答過程。bHLH轉(zhuǎn)錄因子的第25亞類基因除了參與BR途徑外，還參與ABA等激素途徑[22]。擬南芥中發(fā)現(xiàn)的bHLH92轉(zhuǎn)錄因子，受鹽、干旱、滲透、冷等多種脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，過量表達(dá)bHLH92基因則表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鹽脅迫的能力[6]。Zhou等[21]克隆了OrbHLH2基因，在擬南芥中過表達(dá)OrbHLH2能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性及滲透脅迫抗性。本研究發(fā)現(xiàn)BpBEE2基因?qū)}、旱脅迫后白樺的鮮重產(chǎn)生了影響，并且改善了植物的抗旱、耐鹽性。BpBEE2如何通過如何調(diào)控植株的生長及參與抗旱耐鹽脅迫應(yīng)答還需要進(jìn)一步深入研究。