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(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457)

尿苷廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)，特別是作為醫(yī)藥中間體生產(chǎn)一些抗病毒、抗腫瘤藥物，如碘苷、溴苷和氟苷等，能夠阻斷各種癌細(xì)胞和病毒的基因合成，治療癌癥或由病毒引起的疾病[1-2]。隨著抗病毒和抗腫瘤藥物的深入研發(fā)，市場對尿苷的需求量大幅上升，迫切需要成本低且能夠大規(guī)模生產(chǎn)的尿苷生產(chǎn)工藝[3]。目前，工業(yè)上主要是以D-核糖和尿嘧啶為原料，采用化學(xué)合成的方法制備尿苷，該法原料價格昂貴，生產(chǎn)成本高[4-5]。價格低廉，環(huán)境友好，工藝相對簡單的發(fā)酵法是公認(rèn)的生產(chǎn)尿苷的理想方法，也是當(dāng)前尿苷研究的主流方向[6]。本實驗室在前期的研究工作中獲得了一株可以高產(chǎn)尿苷的枯草芽孢桿菌F126[7]。本研究對枯草芽孢桿菌F126發(fā)酵產(chǎn)尿苷的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，通過PB實驗方法確定培養(yǎng)基中影響F126尿苷產(chǎn)量的最顯著因素是酵母浸粉，對來源于不同廠家、不同型號的酵母粉產(chǎn)品進行篩選，并對所篩酵母粉的使用量和使用方法進行了優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材 料

菌種：枯草芽孢桿菌F126，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院代謝工程研究室保存。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂20 g/L。滅菌條件為121 ℃，20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO42 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO41 g/L。葡萄糖單獨滅菌，滅菌條件為115 ℃，15 min;其余組分滅菌條件為121 ℃，20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，豆粕水解液30 mL/L，玉米漿20 mL/L，酵母浸粉15 g/L，谷氨酸鈉10 g/L，尿素5 g/L，MgSO4·7H2O 8 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO42 g/L，KH2PO41 g/L。其中葡萄糖和玉米漿單獨滅菌，葡萄糖滅菌條件為115 ℃，15 min;玉米漿滅菌條件為121 ℃，20 min;其余組分滅菌條件為115 ℃，15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

所用5 L發(fā)酵罐購自上海保興生物工程設(shè)備有限公司；所用高效液相色譜儀為Agilent 1200，購自美國安捷倫科技公司。

1.3 方 法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

用接種環(huán)接種1環(huán)從-80 ℃取出的凍存菌液，均勻劃線于斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，并傳代一次。

1.3.2 種子培養(yǎng)

用接種環(huán)刮取1環(huán)斜面種子接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，9層紗布封口，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵

吸取3 mL種子液接種于裝有27 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板三角瓶中，9層紗布封口，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵過程中補加質(zhì)量濃度為800 g/L的滅菌后的葡萄糖溶液，以維持發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度在5～80 g/L。

1.3.4 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵

將種子液按照V(種子液)∶V(發(fā)酵定容)=15∶100的接種量接種至滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，總體積為3 L。培養(yǎng)溫度37 ℃，自動流加氨水，控制發(fā)酵罐內(nèi)混合物pH在7.0左右，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量，控制相對溶氧在20%～30%，過程中流加800 g/L葡萄糖溶液，維持葡萄糖質(zhì)量濃度在1～3 g/L。

1.3.5 分析方法

生物量通過分光光度計測量菌液在600 nm下的吸光度OD600來表征；葡萄糖濃度采用SBA-40C生物傳感儀測定。

采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中尿苷的濃度，色譜柱為Phenomenex Gemini 5u C18110A 150 mm×4.6 mm，柱溫30 ℃，流動相為V(乙腈)∶V(水)=2∶98，流速1 mL/min，每個樣品進樣20 μL，紫外檢測波長270 nm，分析時間12 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 PB實驗確定影響尿苷產(chǎn)量的顯著因素

Plackett-Burman(PB)實驗設(shè)計的原理是基于不完全平衡模塊原理，是一種近飽和的兩水平優(yōu)化的試驗方法，可以通過較少的試驗次數(shù)使眾多因素的主效應(yīng)得到盡可能精確的估計，從眾多考察因素中快速篩選出最為重要的幾個因素，以供進一步研究[8-9]。

本研究采用N=12的PB設(shè)計，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕水解液X2、玉米漿X3、酵母浸粉X4、谷氨酸鈉X5、尿素X6、MgSO4·7H2OX7、(NH4)2SO4X8、KH2PO4X9和KH2PO4X10進行考察，X1為無添加情況。每個因素取兩個水平，即高水平(+)和低水平(-)，其中高水平為低水平的1.5倍，響應(yīng)值Y為尿苷產(chǎn)量(g/L)。實驗設(shè)計及發(fā)酵尿苷產(chǎn)量見表1。

表1 N=12 的Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)值

利用Minitab 16軟件對結(jié)果進行分析，各因素的編碼水平和主效應(yīng)分析見表2。其中P值大小代表了該因素的顯著性水平，P<0.05說明該因素效應(yīng)顯著，P<0.01則效應(yīng)極顯著。由表2可知：酵母浸粉、谷氨酸鈉和豆粕水解液對尿苷產(chǎn)量有顯著影響的因素，且酵母浸粉對尿苷產(chǎn)量的影響最為顯著。

表2 各因子實驗水平及主效應(yīng)分析Table 2 Levels of variables and analysis of the main effect

2.2 不同型號的酵母浸粉對尿苷發(fā)酵過程的影響

酵母浸粉即粉狀酵母浸出物，是以高蛋白面包酵母或啤酒酵母為原料，經(jīng)自溶、酶解、濃縮和干燥等工藝制成的一種富含蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、多肽、核酸、維生素及微量元素等營養(yǎng)成分的生物培養(yǎng)基產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)[10]。因受原料來源、生產(chǎn)工藝以及酵母浸粉本身組分的復(fù)雜性的影響，不同廠家、型號和批次的酵母浸粉質(zhì)量存在差異，從而影響其使用效果[11]。本研究通過單因素實驗的方法考察了7種不同來源、不同型號的酵母浸粉對尿苷發(fā)酵的影響，分別是OXOID LP0021(LP)、Springer 2506(S2506)、Springer 800(S5041)、Springer 5041(S5043)、安琪FM802(FM803)、安琪FM888(FM888)和安琪FM902(FM902)。用上述7種酵母浸粉進行尿苷發(fā)酵所得結(jié)果見圖1。

圖1 使用不同型號酵母浸粉時的尿苷發(fā)酵結(jié)果 Fig.1 Results of uridine fermentation with different types of yeast extract

從結(jié)果可以看出：來源于不同廠家不同型號的酵母浸粉對發(fā)酵過程中菌體的生長和尿苷的產(chǎn)量會產(chǎn)生不同的影響。七種酵母浸粉中，Springer公司5041型的酵母浸粉對菌體生長最為有利，而2506型號的酵母浸粉則更有利于尿苷的積累。酵母原料及生產(chǎn)工藝的不同會導(dǎo)致不同廠家、不同型號的酵母浸粉中各種組分含量具有差異，從而對尿苷發(fā)酵產(chǎn)生不同的影響[12]。

2.3 不同的酵母浸粉用量對尿苷發(fā)酵過程的影響

在確定了最佳的酵母浸粉型號以后，本研究采用單因素實驗的方法[13]考察了不同酵母粉的使用量對尿苷發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。在一定范圍內(nèi)，隨著酵母浸粉用量的增加，菌體的生長變佳，尿苷產(chǎn)量也逐步提升，但是使用過量的酵母浸粉后，無論是菌體的生長還是尿苷的產(chǎn)量都開始呈現(xiàn)下降趨勢。鏡檢發(fā)現(xiàn)：使用過量的酵母浸粉后，發(fā)酵后期會有大量芽孢生成，可能是因為前期營養(yǎng)太豐富，導(dǎo)致菌體增殖太快，營養(yǎng)急劇消耗；后期營養(yǎng)缺乏，導(dǎo)致芽孢生成。較為適宜的酵母浸粉用量為20 g/L。

圖2 不同酵母浸粉使用量的尿苷發(fā)酵結(jié)果 Fig.2 Results of uridine fermentation with different dosage of yeast extract

2.4 酵母浸粉添加方式對尿苷發(fā)酵過程的影響

本研究通過發(fā)酵罐發(fā)酵的方法對比了酵母浸粉的3種不同添加方式對尿苷發(fā)酵的影響。第一種方式是將所有的酵母浸粉全部通過底料添加(20 g/L)；第二種方式是通過底料添加一部分酵母浸粉(10 g/L)，然后在發(fā)酵過程中再添加一部分(10 g/L)；第三種方式是通過底料添加一部分酵母浸粉(5 g/L)，其余的隨著葡萄糖一起流加(15 g/L)。發(fā)酵結(jié)果如圖3，4所示。從發(fā)酵結(jié)果看：按第一種方式使用酵母浸粉，菌體前期生長迅猛，生物量很快達(dá)到峰值，但是菌體會提前衰亡，導(dǎo)致發(fā)酵周期過短；而第三種方式，可以很好地控制菌體的生長，菌體活力維持時間更久，更有利于尿苷的發(fā)酵[14]。在酵母浸粉隨糖流加的條件下發(fā)酵40 h，發(fā)酵液中尿苷質(zhì)量濃度可達(dá)26.2 g/L，相比酵母浸粉底料添加的方式，尿苷產(chǎn)量提高了101.5%。

圖3 酵母浸粉不同添加方式下的菌體生長曲線 Fig.3 Growth curve of strain under different usages of yeast extract

圖4 酵母浸粉不同添加方式下的尿苷產(chǎn)量 Fig.4 Titer of uridine in fermentation under different usages of yeast extract

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明：酵母浸粉是培養(yǎng)基中影響尿苷產(chǎn)量的最顯著因素。酵母粉的種類、使用量和使用方式皆會影響尿苷發(fā)酵生產(chǎn)。通過對比不同廠家、不同型號的酵母浸粉對尿苷發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)Springer公司所產(chǎn)的2506型號的酵母浸粉最有利于尿苷發(fā)酵，并摸索出其最佳的使用量為20 g/L。在尿苷分批補料發(fā)酵的過程中，5 g/L的酵母浸粉在底料中添加，其余的15 g/L隨糖流加更有利于發(fā)酵過程中尿苷

的積累，在最優(yōu)條件下，枯草芽孢桿菌F126在5 L發(fā)酵罐上發(fā)酵40 h后可積累尿苷26.2 g/L。