孫茜茜 李春強(qiáng) 易小平

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南?？?71101)

茄子枯萎病和香蕉枯萎病都是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的真菌性病害。茄子枯萎病是茄科蔬菜的主要病害，近年來(lái)有加重趨勢(shì)。香蕉枯萎病是目前香蕉最嚴(yán)重的病害，制約著香蕉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。枯萎病的防治方法雖有多種，抗病品種選育是關(guān)鍵，但進(jìn)程緩慢，作物也會(huì)隨著病原菌的致病性變異而重新染??；化學(xué)防治簡(jiǎn)單快速，卻易造成環(huán)境污染，病原菌易產(chǎn)生抗藥性等副作用；目前生物防治安全、高效，越來(lái)越受到人們的關(guān)注［1]，是值得推廣的防治方法。微生物菌劑的應(yīng)用是生物防治的重要方面，通過(guò)生防菌的生命活動(dòng)，使土壤酶活性增強(qiáng)，難溶性礦物養(yǎng)分被分解，或通過(guò)分泌植物激素［2]，增加植物養(yǎng)分的供應(yīng)量和促進(jìn)植物生長(zhǎng)［3]，或改變根際菌群主導(dǎo)微生物群落，從而減少病原體在植物根際的定殖等［4]。生防菌篩選一直是病害防治的重要方面，微生物菌劑具有良好的應(yīng)用前景。

芽孢桿菌（Bacillus）是一類好氧或兼性厭氧的能形成抗逆性芽孢（內(nèi)生孢子）的桿菌，具有種類多、繁殖快、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，芽孢桿菌屬的各類有益菌株在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及醫(yī)學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。目前應(yīng)用廣泛的芽孢桿菌各有不同的功效，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）會(huì)產(chǎn)生多肽類活性物質(zhì)和生物表面活性素，對(duì)致病菌有明顯抑制作用；膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus） 主要用于固氮、解磷、解鉀，增進(jìn)土壤肥力，提高營(yíng)養(yǎng)元素；地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）對(duì)灰霉病菌和炭疽病菌有抑制作用［5]；巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）作為溶磷菌，可以提高作物產(chǎn)量；解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amylo‐liquefaciens）具有促生、防病及定殖能力。本實(shí)驗(yàn)室先前分離篩選了8 種生防菌，分別是JK01菌、JK02 菌、JK2015 菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，現(xiàn)針對(duì)茄子枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.melongenae）和香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.cubense）兩種病原真菌拮抗菌株進(jìn)行初步篩選，以期尋找合適的微生物菌劑可以有效防治茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌。結(jié)合生防菌的不同特性，并測(cè)定菌株間是否能夠包容生長(zhǎng)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)混合微生物肥料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：茄子枯萎病菌尖孢鐮刀菌茄子專化型（Fusarium oxysporumf. sp. melongenae，F(xiàn)om）由福建農(nóng)科院肖榮鳳老師惠贈(zèng)；香蕉枯萎病菌尖孢鐮刀菌古巴?；? 號(hào)小種（Fusarium oxysporumf.sp.cubenserace 4，F(xiàn)oc4）本室分離保存；生防菌為JK01 菌、JK02 菌、JK2015 菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，均由本室分離保存。供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、LB固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

抑菌試驗(yàn)：采用平板對(duì)峙法進(jìn)行8種生防菌對(duì)茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌活性測(cè)定。分別將茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌菌餅接種于PDA 固體平板中央，在距離菌餅2.5 cm 處接種細(xì)菌菌株，3 次重復(fù)試驗(yàn)，以不接種生防菌的病原菌作為對(duì)照，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種5 d 后，采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑（即：每個(gè)菌落橫著測(cè)一次豎著測(cè)一次求平均值，目的是減小誤差，因?yàn)榫洳⒎嵌际钦龍A形的；如果遇到有的橢圓型菌落橫豎測(cè)量值相差大于1 cm，將舍棄此數(shù)據(jù)，以其它重復(fù)計(jì)算）。抑制率計(jì)算參照文獻(xiàn)［6]進(jìn)行，具體計(jì)算公式為：抑制率＝［對(duì)照菌落擴(kuò)展直徑（mm）－處理組菌落擴(kuò)展直徑（mm）]/對(duì)照菌落擴(kuò)展直徑（mm）×100%，其中：菌落擴(kuò)展直徑（mm）＝菌落測(cè)量直徑（mm）－菌餅直徑（mm）。采用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。包容性生長(zhǎng)測(cè)試：用接種環(huán)分別對(duì)8 種生防菌進(jìn)行LB 固體平板劃線，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后，挑取單菌落，并接種于LB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌活化。將已活化的8 種生防菌菌液，采用三三組合方式在LB 固體平板上劃線，劃線的3種細(xì)菌盡量靠近但不貼在一起，3 個(gè)重復(fù)；然后28℃培養(yǎng)2 d 后，觀察彼此之間是否能生長(zhǎng)在一起。若彼此之間能夠融合生長(zhǎng)，或菌斑邊緣界限雖然清楚但能夠重疊生長(zhǎng)在一起（可能是一種共處關(guān)系），則認(rèn)為彼此之間能夠包容生長(zhǎng)，標(biāo)記為“＋”；若彼此之間有明顯的抑制，即菌斑邊緣界限較大或不能生長(zhǎng)在一起，而且有明顯的排它性，則認(rèn)為彼此之間不包容生長(zhǎng)，標(biāo)記為“－”。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種生防菌的抑菌效果

2.1.1 生防菌對(duì)茄子枯萎病菌的抑菌效果

8 種生防菌對(duì)茄子枯萎病菌的抑菌效果見(jiàn)圖1。

圖1 8種生防菌對(duì)茄子枯萎病菌的抑制效果

從圖1可以看出，巨大芽孢桿菌對(duì)茄子枯萎病菌生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，抑菌率只有6.1%。地衣芽孢桿菌對(duì)茄子枯萎病菌和也無(wú)明顯抑菌作用，抑菌率只有3.48%。其余6 種生防菌對(duì)茄子枯萎病菌都有抑菌效果，抑菌率為28.99%～52.54%，抑菌效果JK2015 菌＞膠凍樣芽孢桿菌＞JK02 菌＞JK01 菌＞枯草芽孢桿菌＞解淀粉芽孢桿菌（見(jiàn)表1）；其中JK2015菌的抑菌活性（抑菌率為52.54%）顯著高于膠凍樣芽孢桿菌（抑菌率為48.48%），膠凍樣芽孢桿菌抑菌活性顯著高于JK01 菌（抑菌率為43.24%），JK01 菌和JK02 菌（抑菌率為46.11%）抑菌活性顯著高于枯草芽孢桿菌（抑菌率為34.42%）；枯草芽孢桿菌顯著高于解淀粉芽孢桿菌（抑菌率為28.99%）。

2.1.2 生防菌對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌效果

8 種生防菌對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌效果見(jiàn)圖2。

圖2 8種生防菌對(duì)香蕉枯萎病菌的抑制效果

從圖2可以看出，巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對(duì)香蕉枯萎病菌Foc4 均無(wú)明顯抑菌作用，抑菌率分別只有6.3%和7.25%；其余6 種生防菌對(duì)Foc4都有一定的抑菌效果，抑菌率為54.92%～70.45%不等，抑菌效果JK2015 菌＞膠凍樣芽孢桿菌＞JK02 菌＞JK01 菌＞枯草芽孢桿菌＞解淀粉芽孢桿菌（表1）。其中JK2015 菌的抑菌活性和膠凍樣芽孢桿菌差異不顯著，JK02 菌的抑菌活性和JK01 菌差異不顯著，但是前兩者抑菌活性都顯著高于后兩者，JK2105、膠凍樣芽孢桿菌、JK02 菌和JK01菌抑菌率分別為70.45%、69.29%、66.35% 和65.92%；JK01 菌和JK02 菌的抑菌活性顯著高于枯草芽孢桿菌菌（抑菌率為61.10%）；枯草芽孢桿菌顯著高于解淀粉芽孢桿菌（抑菌率為54.92%）。

表1 8種生防菌對(duì)茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌率測(cè)定結(jié)果 單位：%

2.2 8種生防菌包容性生長(zhǎng)試驗(yàn)

對(duì)JK01 菌、JK02 菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、JK2015菌8種生防菌相互間是否能夠包容生長(zhǎng)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3、4。結(jié)果表明，JK01 菌不能與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌包容生長(zhǎng)；JK02 菌不能與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌包容生長(zhǎng)；枯草芽孢桿菌不能與JK01 菌、JK02 菌、膠凍樣芽孢桿菌包容生長(zhǎng)；而其余菌株之間均可以包容生長(zhǎng)。其中，巨大芽孢桿菌與其它菌株均可以包容生長(zhǎng)；地衣芽孢桿菌與其它菌株均可以包容生長(zhǎng)；JK2015 菌與其它菌株均可以包容生長(zhǎng)；膠凍樣芽孢桿菌除不能與枯草芽孢桿菌包容外，與其它菌株均可以包容生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)農(nóng)業(yè)長(zhǎng)期過(guò)度依賴化肥，土壤生態(tài)質(zhì)量遭到嚴(yán)重破壞，采用生物防治的方法防治植物病害已成為大趨勢(shì)。選用多種能夠包容性生長(zhǎng)的生防菌，配成混合菌劑并結(jié)合田間試驗(yàn)以獲得廣譜高效的、易于培養(yǎng)的微生物菌劑或微生物肥料，對(duì)于植物病害的防治具有重要意義。為了減少化肥和化學(xué)農(nóng)藥使用，近年來(lái)復(fù)合微生物菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中越來(lái)越發(fā)揮著重要作用。葉乃瑋等［7]發(fā)現(xiàn)，組合木霉菌可濕性粉劑比單一木霉菌更能顯著降低香蕉枯萎病的病情，同時(shí)還利于提高香蕉產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)在常規(guī)施肥基礎(chǔ)上施用復(fù)合微生物菌劑對(duì)作物花椰菜、茶葉、葡萄、翠冠梨都有較好增產(chǎn)增收效果［8]。采用復(fù)合微生物菌劑與氨基酸水溶肥組合能有效抑制根結(jié)線蟲(chóng)的增長(zhǎng)和根結(jié)的形成，抑制率高于90%［9]。但是，了解各微生物之間能否包容生長(zhǎng)對(duì)其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用十分重要。

圖3 8種生防菌間的包容性生長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

為了解生防菌之間的生長(zhǎng)是否相互影響，采用平板劃線共培養(yǎng)，開(kāi)發(fā)出一種快速檢測(cè)方法，對(duì)8種生防菌之間的包容性做出快速初篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：JK01 和JK02 不能與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌包容生長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌不能與膠凍樣芽孢桿菌包容生長(zhǎng)，其余菌株間都可以包容生長(zhǎng)。微生物包容生長(zhǎng)機(jī)制比較復(fù)雜，但一般認(rèn)為，微生物之間的生長(zhǎng)不受對(duì)方影響就認(rèn)為包容，當(dāng)然有的還能互相促進(jìn)，如由巨大芽孢桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacterium oxydans）等伴生菌的維生素C發(fā)酵中，后者難以單獨(dú)培養(yǎng)，而前者可以為后者提供生產(chǎn)因子和生物活性物質(zhì)協(xié)助后者合成維生素C 前體2-酮基-L-古龍酸［10]。本研究中各生防菌間的關(guān)系及包容性只是初步結(jié)果，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。

圖4 8種生防菌間的包容性生長(zhǎng)測(cè)試

同時(shí)，為明確幾種生防菌對(duì)茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌效果，采用平板對(duì)峙法進(jìn)行抑菌譜試驗(yàn)。結(jié)果表明，JK2015 菌對(duì)茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌效果最為明顯，而巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對(duì)兩種病原真菌均無(wú)明顯的抑菌效果；對(duì)兩種病原菌的抑菌效果為：JK2015 菌＞膠凍樣芽孢桿菌＞JK02 菌＞JK01 菌＞枯草芽孢桿菌＞解淀粉芽孢桿菌。

上述結(jié)果，為微生物混合菌劑及茄子和香蕉專用生物肥料的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。