楊秀娟， 陶琳麗， 鄧 斌， 曹志勇， 黃 偉， 陶 冶， 戚 敏， 張 曦*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201；3.云南省農(nóng)村科技服務(wù)中心，云南昆明650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，云南昆明650201；5.云南省飼料工業(yè)協(xié)會(huì)，云南昆明650201）

蛋白質(zhì)是維持機(jī)體生命活動(dòng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)代謝模式認(rèn)為蛋白質(zhì)必須水解成游離氨基酸后通過氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體吸收入機(jī)體后被動(dòng)物體吸收利用。然而，研究發(fā)現(xiàn)含2個(gè)或3個(gè)氨基酸的小肽是蛋白質(zhì)水解的主要產(chǎn)物（Adibi，1973），并且其可以通過載體直接被吸收。許多試驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)在降解為氨基酸的過程中產(chǎn)生的中間體小肽可被動(dòng)物體直接吸收（Agar，1953）。小肽能在腸道轉(zhuǎn)運(yùn)載體協(xié)助下直接被完整的吸收，具有吸收速度快、載體不易飽和、耗能低且效率高的特點(diǎn)，而且以小肽形式供給氨基酸可以避免游離氨基酸因競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)而造成的抑制效應(yīng)，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)飼料的吸收及轉(zhuǎn)化（Gilbert，2008；Hara，1984）。本試驗(yàn)以雞肉為原料，探索鹽酸水解方法制備2～3個(gè)氨基酸組成的雞肉小肽產(chǎn)品的工藝條件，并通過正交試驗(yàn)以期獲得最優(yōu)水解工藝條件，為雞肉深加工利用研制出一種營(yíng)養(yǎng)豐富，安全可靠的小肽產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 雞肉，購(gòu)至市場(chǎng)，切碎用攪拌機(jī)進(jìn)行攪碎后供水解使用。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 全自動(dòng)凱氏定氮儀（SKD-1000），上海沛歐分析儀器有限公司；pH計(jì)（pHS-3D），上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 試劑 中性甲醛溶液（36%），應(yīng)不含有聚合物，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH為7.0；0.1 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液；0.05 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在110℃的溫度下分別對(duì)水解時(shí)間（4、6、8 h）、鹽酸濃度（2、4、6 mol/L）、料液比（1∶2、1∶3、1∶4）3個(gè)因素3個(gè)水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共9組，見表1。以肽鏈長(zhǎng)度為指標(biāo)確定雞肉小肽的最佳水解工藝參數(shù)。

1.2.2 樣品制備 取（2.50±0.0001）g雞肉于水解管中，按表1中添加不同濃度、不同體積的酸溶液，抽真空后用噴燈將水解管管口封嚴(yán)，置于（110±1）℃烘箱中水解不同的時(shí)間。取出水解管，待其冷卻后切開，用定性濾紙過濾至25 mL容量瓶?jī)?nèi)，定容至刻度。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1 總氨基態(tài)氮的測(cè)定 采用甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定，吸取5 mL水解液，加50 mL水，置于100 mL燒杯中開動(dòng)磁力攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mol/L）滴定至酸度計(jì)指示pH 8.2，加入10.0 mL中性甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mol/L）繼續(xù)滴定至pH 9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.05 mol/L)的毫升數(shù)。試樣中總氨基態(tài)氮的含量按下式進(jìn)行計(jì)算（陳鈞輝等，2008）。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L9（33）

式中：X為試樣中總氨基態(tài)氮的含量，mg/g；V1為測(cè)定試樣加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V2為空白試樣加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V3為試樣取用量，mL；V4為水解液定容體積，mL；m為雞肉樣品重量，g；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；0.014為與1.00 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（1.00 mol/L）相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g。

1.3.2 總氮含量的測(cè)定 采用全量凱氏定氮法，吸取5 mL水解液到消化管底部（不要黏在管壁內(nèi)），加入0.4 g無水硫酸銅、6 g無水硫酸鉀和10 mL濃硫酸，置于消化爐上加熱，消化到顏色由淡黃色變成透明的藍(lán)綠色并無黑色雜質(zhì)時(shí)停止消化，待消化管在消化爐中冷卻到室溫時(shí)，取下消化管并加入少量的蒸餾水（農(nóng)業(yè)部人事勞動(dòng)司，2008），上機(jī)待測(cè)。

原料中的總氮含量計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣中總氮含量，mg/g；V1為滴定試樣時(shí)所消耗的硫酸體積，mL；V2為滴定空白試樣時(shí)所消耗的硫酸體積，mL；V3為試樣取用量，mL；V4為水解液定容體積，mL；m為雞肉樣品重量，g；c為硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；0.014為與1.00 mL硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（1.00 mol/L）相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g。

每個(gè)容量瓶做2個(gè)平行測(cè)定，以其算數(shù)平均值為結(jié)果。

1.3.3 氮水解回收率的計(jì)算 氮回收率是指蛋白質(zhì)在水解過程中氮的損失程度，計(jì)算公式為：

式中：N1為凱氏定氮法測(cè)定的水解液中的氮含量，g/mL；V為水解液的總體積，mL；N2為凱氏定氮法測(cè)定雞肉中的氮含量，g/g；m為雞肉樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 水解度的計(jì)算公式（楊文博，2014）

式中：總氨基態(tài)氮采用甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定；總氮含量采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 平均肽鏈長(zhǎng)度的估計(jì)（Adler-Nissen，1986）

APL≈1/DH×100%。

設(shè)定APL為水解后可得到的多肽的平均鏈長(zhǎng)。本試驗(yàn)擬制備2～3個(gè)氨基酸殘基的雞肉小肽，2～3個(gè)氨基酸殘基的雞肉小肽的平均肽鏈長(zhǎng)應(yīng)為2～3，因此選定水解度為33%～50%時(shí)能滿足雞肉小肽的要求。

1.3.6 肽分子平均相對(duì)分子質(zhì)量（Suh，2000）（PMW） PMW計(jì)算公式如下：

PMW=平均肽鏈長(zhǎng)度×氨基酸平均相對(duì)分子質(zhì)量；

式中：氨基酸平均相對(duì)分子質(zhì)量為120。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水解條件對(duì)雞肉氮水解回收率與水解度的影響 由表2可知，不同水解條件對(duì)各理組間的氮水解回收率、氨基態(tài)氮、總氮和水解度有顯著的影響（P＜0.05）。從氮水解回收率來看，組1、組4的氮水解回收率比較低，顯著低于其余7個(gè)組的氮水解回收率 （P＜0.05），較組3顯著降低33.04%、33.66%（P＜0.05）。

從水解度來看，水解條件對(duì)組3、組5、組6、組8與組9的水解度影響不大（P＞0.05），但與組1的水解度相比分別顯著提高29.2%、27.4%、24.9%、30.94%、33.48%（P＜0.05）；水解條件對(duì)組2與組4間的以及組2與組7間的水解度沒有顯著影響（P＞0.05），但與組1的水解度相比分別顯著提高13.8%、8.25%、17.3%（P＜0.05）。

2.2 不同水解條件對(duì)雞肉小肽平均肽鏈長(zhǎng)度和小肽平均分子量的影響 由表3可知，水解條件對(duì)各試驗(yàn)組間平均肽鏈長(zhǎng)度（APL）、PMW兩個(gè)指標(biāo)都有顯著的影響（P＜0.05），組1的平均肽鏈長(zhǎng)度、肽分子平均相對(duì)質(zhì)量顯著高于其余組（P＜0.05），而組4的平均肽鏈長(zhǎng)度、肽分子平均相對(duì)質(zhì)量顯著低于其余組（P＜0.05）。水解條件對(duì)組3、組6、組8、組9間平均肽鏈長(zhǎng)度、肽分子平均相對(duì)質(zhì)量影響顯著（P＜0.05），與組1相比平均肽鏈長(zhǎng)度分別減少1.34、1.4、1.38、1.56，肽分子質(zhì)量減少159.83、146.08、164.67、171.98。水解條件對(duì)組2、組7間平均肽鏈長(zhǎng)度、肽分子平均相對(duì)質(zhì)量沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.3 不同水解條件對(duì)水解效果的主效應(yīng)分析為比較不同水解條件對(duì)總氨、總氨基態(tài)氮含量、氮水解回收率、水解度等因素影響的主次順序，采用極差方法，以極差值大小確定各因素的影響主次順序，結(jié)果見表4。

表2 不同水解工藝水解結(jié)果比較分析

表3 雞肉小肽平均肽鏈長(zhǎng)度和小肽平均分子量比較分析

表4 不同水解條件對(duì)水解效果指標(biāo)的主效應(yīng)分析表

從表4看出，水解時(shí)間、鹽酸濃度、料液比3個(gè)水解條件對(duì)氮水解回收率、總氮兩個(gè)指標(biāo)的影響主效應(yīng)是一樣的，即鹽酸濃度＞料液比＞時(shí)間，水解時(shí)間、鹽酸濃度、料液比3個(gè)水解條件對(duì)氨基態(tài)氮、水解度、平均肽鏈長(zhǎng)度、肽分子平均相對(duì)分子質(zhì)量4個(gè)指標(biāo)的影響主效應(yīng)也是一樣的，即鹽酸濃度＞時(shí)間＞料液比。

為了更直觀的反映水解條件對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響規(guī)律和趨勢(shì)，以水解條件為橫坐標(biāo)，以試驗(yàn)指標(biāo)的平均值為縱坐標(biāo)，繪制指標(biāo)的趨勢(shì)圖（圖1～圖6）。

圖1 水解條件對(duì)總氮的影響趨勢(shì)圖

圖2 水解條件對(duì)氨基態(tài)氮的影響趨勢(shì)圖

圖3 水解條件對(duì)水解度的影響趨勢(shì)圖

圖4 水解條件對(duì)氮回收率的影響趨勢(shì)圖

圖5 水解條件對(duì)平均肽鏈長(zhǎng)度的影響趨勢(shì)

圖6 水解條件對(duì)肽平均分子量的影響趨勢(shì)圖

從圖1～圖6中可以看出，水解時(shí)間、鹽酸濃度、料液比3個(gè)水解條件對(duì)總氮、氨基態(tài)氮、水解度、氮回收率的影響趨勢(shì)是相同的，即隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)、鹽酸濃度、料液比的增加，總氮、氨基態(tài)氮、水解度、氮回收率也隨著增加；而平均肽鏈長(zhǎng)度、肽平均分子質(zhì)量則逐漸減小，說明隨著水解條件的變化，蛋白質(zhì)逐漸被水解為不同肽鏈長(zhǎng)度的小肽，底物蛋白質(zhì)分解增多，但是蛋白質(zhì)分解成的肽也進(jìn)一步降解為氨基酸，從而肽含量增加程度減小。

3 討論

研究中設(shè)計(jì)的水解時(shí)間、鹽酸濃度和料液比3個(gè)水解條件中，鹽酸濃度是影響試驗(yàn)指標(biāo)的主要因素。這是由于溶液中氫離子濃度越高，則蛋白質(zhì)肽鍵被切斷的可能性越大，酸量的增加必然提高了酸對(duì)蛋白質(zhì)的作用能力（馬永全等，2010）。馬永全等（2010）采用酸法水解河蜆蛋白質(zhì)，以水解度為指標(biāo)，通過對(duì)鹽酸、檸檬酸、乳酸的單因素試驗(yàn)，確定選用5%鹽酸可獲得較好的水解效果，通過鹽酸的優(yōu)化正交試驗(yàn)，選擇水解時(shí)間、溫度、鹽酸用量、料液比4因素3水平的正交設(shè)計(jì)，得到河蜆蛋白質(zhì)酸水解的最佳條件為：鹽酸用量5.5%，溫度100℃，水解時(shí)間9 h，料液比1∶3，河蜆蛋白質(zhì)水解度達(dá)到59.34%，鹽酸水解河蜆蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)水解度隨著鹽酸用量的增加而呈上升趨勢(shì)，與本試驗(yàn)獲得的趨勢(shì)一致。方富永等（2009）利用6 mol/L的HCl溶液對(duì)波紋巴非蛤肉進(jìn)行水解發(fā)現(xiàn)，波紋巴非蛤肉中氨基酸含量豐富，包括人體必需的7種氨基酸。而且，鮮味氨基酸豐富，可用于制作營(yíng)養(yǎng)豐富的氨基酸口服液或高級(jí)調(diào)味料。陳曉剛等（2011）采用響應(yīng)面分析法對(duì)酸水解制備波紋巴非蛤小分子肽工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得的最優(yōu)酸水解條件為：固液質(zhì)量比1∶3、鹽酸濃度6.4 mol/L、酸水解溫度92℃、酸水解時(shí)間5.3 h，在此條件下肽得率為82.21%，與鹽酸濃度固定為6 mol／L的條件下，隨著酸水解溫度的升高，肽得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，主要是因?yàn)闇囟冗^高，小分子肽開始大量地進(jìn)一步分解為游離氨基酸，導(dǎo)致肽得率下降。喬偉等（2006）用6 mol/L的鹽酸水解大豆分離蛋白質(zhì)，得到適宜的水解條件為溫度90℃，水解時(shí)間5 h，終產(chǎn)物中二肽和三肽含量為19.38%。李培駿等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，水解度控制是水解過程的關(guān)鍵，預(yù)制備含3～8個(gè)氨基酸殘基的小肽水解物，即水解度控制在10.0%～34.0%。鄧勇等（2001）利用葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）柱層析和高壓液相色譜（HPLC）測(cè)定大豆多肽分子質(zhì)量與水解度的關(guān)系，隨著大豆蛋白質(zhì)水解度的增加，大豆多肽混合物的分子質(zhì)量變小，用水解度估算的大豆多肽混合物分子質(zhì)量與理論計(jì)算相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了利用水解度判斷肽分子質(zhì)量的可行性。本試驗(yàn)所得水解產(chǎn)物中因含有大量的酸，若能去除其中的酸，則可提高水解物中的肽含量，提高實(shí)際的應(yīng)用效果。

4 結(jié)論

鹽酸濃度是決定水解效果的主要因素，水解2～3個(gè)氨基酸為主的雞肉小肽的最優(yōu)水解工藝條件為：鹽酸濃度4mol/L，料液比1∶3，水解時(shí)間4h。在最優(yōu)工藝條件下，雞肉中的氮水解回收率為81.79%。