高向陽， 石珍奇

（鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南鄭州450064）

硒是人體必需的微量元素，能提高機(jī)體免疫力，刺激免疫球蛋白及抗體的生成，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗力。人體對(duì)硒的每日安全攝入量為50～200μg，過低會(huì)使人體免疫能力下降，引起胰臟疾病、癌癥、肝病、糖尿病、心血管病、白內(nèi)障、生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生，如果攝入量過多，則會(huì)引起中毒甚至死亡（王永華，2016；鐘秀倩等，2015）。硒的攝入主要來自動(dòng)植物膳食和水源，而富含硒的飼料，能提高動(dòng)物自身的含硒水平，其產(chǎn)出的牛奶、蛋類、肉類產(chǎn)品硒含量也會(huì)隨之增高，對(duì)人體健康產(chǎn)生影響，因此，測(cè)定飼料中的硒具有現(xiàn)實(shí)的積極意義。

硒的檢測(cè)方法有氫化物一原子熒光光譜法（衛(wèi)生部GB5009.93，2017）、分子熒光法（趙艷，2016；周躍花等，2009；楊雁玲，2007）、原子吸收光譜法（可成友等，2015；侯曉芳等，2009）、電感耦合等離子體-質(zhì)譜法（陳永波等，2010）等，上述方法通常需要繪制工作曲線和測(cè)定空白溶液，操作繁瑣，工作費(fèi)時(shí)。緊密內(nèi)插法又稱雙標(biāo)準(zhǔn)比較法，因其簡(jiǎn)便快速，大大提高了工作效率，已在飼料檢測(cè)中得到應(yīng)用（高向陽等，2017），但鮮見測(cè)定硒含量的文獻(xiàn)報(bào)道。分子熒光緊密內(nèi)插法利用在酸性條件下硒與2，3-二氨基萘（DAN）反應(yīng)生成具有強(qiáng)熒光特性的4，5-苯并苤硒腦，其相對(duì)熒光強(qiáng)度與硒的含量成正比的原理，選擇兩個(gè)合適的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液與試液在相同的條件下進(jìn)行測(cè)定。該法將微波消解技術(shù)和分子熒光緊密內(nèi)插法有效結(jié)合，為創(chuàng)建新型測(cè)定飼料中硒的方法提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 仔豬前期配合飼料551、妊娠期母豬配合飼料556、仔豬后期母豬配合飼料552，由河南安必諾檢測(cè)技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備 101—1AS型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DL—1型電子萬用爐，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；XT—9900A型智能微波消解—萃取儀，上海新拓分析儀器科技有限公司；PXSJ-216型離子計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；970CRT型熒光分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 主要試劑 鹽酸、雙氧水、環(huán)己烷、鹽酸羥胺、濃氨水、濃硝酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、100μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，鄭州派尼化學(xué)試劑廠；DAN（2，3-二氨基萘），東京化成工業(yè)株式會(huì)社；甲酚紅，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1%（體積百分?jǐn)?shù)）鹽酸溶液：準(zhǔn)確量取5 mL鹽酸，用水稀釋至500 mL，混勻。

1 g/L DAN試劑：準(zhǔn)確稱取0.1000 g DAN于錐形瓶中，加1%鹽酸溶液100 mL溶解后加入20 mL環(huán)己烷震蕩，移入分液漏斗分層，收集環(huán)己烷層的DAN溶液，反復(fù)用環(huán)己烷進(jìn)行5次純化，使DAN溶液中熒光降到最低，合并DAN溶液，儲(chǔ)存于棕色瓶中，加入約1 cm厚的環(huán)己烷覆蓋，于0～5℃冰箱中冷藏，備用（Serra等，2010）。

鹽酸溶液（1+9）：濃鹽酸和水按體積比1∶9混合后備用；氨水溶液（1+1）∶濃氨水和水按體積比1∶1混勻。

0.2 mol/L EDTA溶液：稱取EDTA-2Na 37g，加水溶解，移入500 mL容量瓶定容，混勻。

100 g/L鹽酸羥胺溶液：稱取10g鹽酸羥胺溶于水中，移入100 mL容量瓶定容，混勻。

0.2 g/L甲酚紅指示劑：稱取甲酚紅指示劑50 mg溶于水中，滴加氨水溶液（1+1)1滴，移入250 mL容量瓶中定容，混勻。

EDTA混合液：取0.2 mol/L EDTA溶液及100 g/L鹽酸羥胺溶液各50 mL，加0.2 g/L甲酚紅指示劑5 mL，加水稀釋至1 L，混勻。

1μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取100μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.00 mL，用1%鹽酸溶液定容至500 mL，混勻，冷藏于冰箱中。

實(shí)驗(yàn)用水為怡寶水，電導(dǎo)率為2.82μS/cm；所用玻璃器皿均用1+5的硝酸溶液浸泡過夜，依次用自來水、怡寶水洗凈后使用。

1.4 方法原理 根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度與濃度在一定條件下呈正比的關(guān)系，用分子熒光緊密內(nèi)插法測(cè)定并計(jì)算硒含量。該法只需比試液濃度較低和較高的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，與試液在相同條件下測(cè)定熒光相對(duì)強(qiáng)度，按公式（1）計(jì)算試液中硒的質(zhì)量濃度，按公式（2）計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/kg）。

式中：I1、I2為標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光相對(duì)強(qiáng)度；Ix為試液的熒光相對(duì)強(qiáng)度；ρx為試液的質(zhì)量濃度，μg/mL；ρ1、ρ2為標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL（要求ρ2＞ρx＞ρ1）。

式中：m為干基樣品的質(zhì)量，g；ω為樣品中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg。

1.5 樣品測(cè)定 樣品經(jīng)研磨、過80目尼龍篩、在80℃下干燥至恒重，稱取0.3000 g（稱準(zhǔn)至0.0001 g）于消解罐內(nèi)，加4 mL濃硝酸和1 mL雙氧水，在加熱板上加熱至冒白煙后，按表1程序消解至澄清透明，放置室溫后定量移入25 mL容量瓶中，用水定容。吸取5.00 mL于250 mL錐形瓶中，加EDTA混合液20.00 mL，滴加氨水溶液（1+1)或鹽酸溶液（1+9）調(diào)pH至1.5。在暗室中加1 g/L DAN試劑4.00 mL混勻，80℃水浴6 min冷卻，加6 mL環(huán)己烷震搖，移入分液漏斗中分層。將環(huán)己烷層傾入熒光液槽中，以387 nm為激發(fā)光，以514 nm為發(fā)射光，在與兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液完全相同的條件下測(cè)定熒光相對(duì)強(qiáng)度。

表1 微波消解程序

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光激發(fā)波長(zhǎng)的選擇 取0.5μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL于燒杯中，加20.00 mL EDTA混合液，滴加氨水溶液（1+1）或鹽酸溶液（1+9）調(diào)pH至1.5。避光條件下加1 g/L DAN試劑4.00 mL，混勻，80℃水浴6 min冷卻，移入分液漏斗中加6 mL環(huán)己烷震搖分層。環(huán)己烷層傾入熒光液槽，在儀器設(shè)定靈敏度為3、EX，EM狹縫均為10 nm、熒光發(fā)射波長(zhǎng)520 nm條件下，選擇300～600 nm激發(fā)光測(cè)定，結(jié)果表明：最佳熒光激發(fā)波長(zhǎng)為387 nm。

2.2 熒光發(fā)射波長(zhǎng)的選擇 選擇最佳熒光激發(fā)波長(zhǎng)387 nm，設(shè)定發(fā)射波長(zhǎng)為300～600 nm，在其他條件同2.1時(shí)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明：最佳熒光發(fā)射波長(zhǎng)EM為514 nm。

2.3 pH的最優(yōu)選擇 向5個(gè)燒杯中各加1 g/L的硒溶液5.00 mL、EDTA 20.00 mL，避光下加入4.00 mL DAN，在PXSJ-216型離子計(jì)上依次調(diào)節(jié)pH為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0，沸水浴加熱6 min，冷卻至室溫后，加6 mL環(huán)己烷震蕩，分層后取環(huán)己烷層，以387 nm為激發(fā)光、514 nm為發(fā)射光測(cè)定，結(jié)果如表2。

由表2可知，在pH為1.5時(shí)測(cè)定的熒光相對(duì)強(qiáng)度最大。

表2 pH對(duì)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光值的影響

2.4 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的選擇 依次配制硒標(biāo)準(zhǔn)溶 液 0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 μg/mL 和0.60μg/mL，分別置于燒杯中，加EDTA 20 mL，調(diào)節(jié)pH至1.5。在暗室中加1 g/L DAN試劑4.00 mL混勻，80℃水浴6 min，冷卻，移入分液漏斗中，加6mL環(huán)己烷震搖，分層。環(huán)己烷層在387 nm激發(fā)光、514 nm發(fā)射光下測(cè)定。

按照1.5操作測(cè)定飼料樣品，試驗(yàn)表明，0.30μg/mL和0.50μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度分別為39.73和40.41，試液的相對(duì)熒光強(qiáng)度在40左右，可滿足I2＞Ix＞I1的要求，故選擇0.30μg/mL和0.50μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行緊密內(nèi)插法操作。

2.5 DAN用量的確定 向5個(gè)燒杯中各加1 g/L的硒溶液5.00 mL、EDTA 20.00 mL，調(diào)節(jié)pH至1.5，在暗室中依次加1 g/L DAN試劑1.00、3.00、4.00、5.00 mL和6.00 mL混勻，80℃水浴6 min，冷卻，移入分液漏斗中，加6 mL環(huán)己烷震搖，分層。在387 nm激發(fā)光、514 nm發(fā)射光下測(cè)定環(huán)己烷層的相對(duì)熒光強(qiáng)度，結(jié)果見表3。

表3 DAN試劑的用量對(duì)硒溶液熒光值的影響

由表3可知，DAN試劑用量為4.00 mL時(shí)熒光相對(duì)強(qiáng)度最強(qiáng)。

2.6 EDTA混合液的用量 EDTA混合液用量分別為15.00、20.00、25.00、30.00 mL和35.00 mL，取1 g/L的硒溶液5.00 mL，按試驗(yàn)步驟測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 EDTA混合液的添加量對(duì)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光值的影響

由表4可知，選擇加入EDTA混合液20.00 mL較為合適。

2.7 水浴時(shí)間的確定 取1 g/L硒溶液5.00 mL，加DAN試劑4.00 mL、EDTA混合液20.00 mL，分別水浴3、6、9、12 min和15 min，按照試驗(yàn)方法測(cè)定，水浴6 min時(shí)熒光相對(duì)強(qiáng)度最強(qiáng)，結(jié)果見表5。

表5 水浴時(shí)間對(duì)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光值的影響

2.8 正交實(shí)驗(yàn) 由單因素實(shí)驗(yàn)，選擇pH、EDTA混合液用量、DAN試劑用量、水浴時(shí)間四因素進(jìn)行三水平的正交實(shí)驗(yàn)。因素水平如表6，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7。

表6 因素水平表

表7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表7可知，最佳實(shí)驗(yàn)條件為A1B2C2D2，即pH至1.5、DAN試劑用量4.00 mL、EDTA混合液用量為20.00 mL、水浴時(shí)間為6 min。由R值可知，對(duì)硒測(cè)定結(jié)果影響的因素順序?yàn)锳＞D＞B＞C，即pH＞水浴時(shí)間＞DAN試劑用量＞EDTA混合液用量。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)熒光值，結(jié)果見表8。

表8 樣品測(cè)定值

由表8可知，仔豬前期配合飼料551含硒5.83 mg/kg，妊娠期母豬配合飼料556含硒6.67 mg/kg。

2.10 加標(biāo)回收率 分別向飼料中加入硒3.00、5.00μg和10.00μg進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。按照分析方法測(cè)定和計(jì)算，結(jié)果如表9。由表9可知，加標(biāo)回收率為92.7%～100%。

表9 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

在硒最佳實(shí)驗(yàn)條件pH 1.5、EDTA混合液用量20.00 mL、DAN試劑用量4.00 mL、水浴時(shí)間6 min條件下，測(cè)得仔豬前期配合飼料551中硒含量為5.83 mg/kg，妊娠期母豬配合飼料556中硒含量為6.67 mg/kg，加標(biāo)回收率為92.7%～100%。分子熒光緊密內(nèi)插法具有快速簡(jiǎn)便、樣品用量少、成本低廉、不需要測(cè)定空白溶液和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)點(diǎn)。