卵母細(xì)胞成熟比例對卵胞漿內(nèi)單精子注射助孕療效的影響

楊冬宇，陳旭龍，謝妍，曹曉靜，李思楠，周文，袁啟龍，陸杉

（廣東省中醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510006）

控制性超促排卵技術(shù)是以藥物的手段，在可控制的范圍內(nèi)誘發(fā)多卵泡的發(fā)育和成熟，以獲取適當(dāng)數(shù)量的成熟卵母細(xì)胞[1]。目前促排卵方案包括短方案、長方案、超長方案及拮抗劑方案等[2-3]。廣義上卵母細(xì)胞的成熟應(yīng)包括細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)同時成熟，成熟卵母細(xì)胞比例體現(xiàn)本周期獲取卵母細(xì)胞整體的成熟度水平[4-5]。本研究擬研究不同卵母細(xì)胞成熟比例對患者胚胎質(zhì)量及臨床妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年6月—2017年12月于廣東省中醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科接受卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）治療的患者194例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①因男方因素首次接受ICSI治療；②年齡≤35歲；③采用長方案行促排卵治療；④獲得卵母細(xì)胞數(shù)目≥3枚。排除標(biāo)準(zhǔn)：①移植前基因診斷或胚胎植入前遺傳學(xué)篩查患者；②卵母細(xì)胞成熟比例≤10%。

根據(jù)不同的卵母細(xì)胞成熟度將患者分為A、B組，分別有107和87例。A組為成熟卵母細(xì)胞數(shù)占獲卵數(shù)比例≥80%，且有移植胚胎的ICSI周期；B組為成熟卵母細(xì)胞占獲取卵母細(xì)胞數(shù)＜80%，且有移植胚胎的ICSI周期。

1.2 卵母細(xì)胞采集

采用標(biāo)準(zhǔn)長方案進(jìn)行卵巢刺激，B超監(jiān)測卵泡生長發(fā)育。當(dāng)有主導(dǎo)卵泡直徑滿足3種情況之一（≥19 mm、2個≥18 mm及3個≥17 mm）時，結(jié)合性激素的檢查結(jié)果，使用人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, HCG）扳機(jī)，當(dāng)晚注射HCG 5 000～10 000 IU，HCG注射后36 h行B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。獲取的卵冠丘復(fù)合物經(jīng)G-MOPs plus培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司）洗滌后，轉(zhuǎn)入經(jīng)平衡過的IVF plus培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司）中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 ICSI

卵冠丘復(fù)合物繼續(xù)在IVF plus培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)4 h（HCG注射后40 h），用透明質(zhì)酸酶（瑞典Vitrolife公司）消化顆粒細(xì)胞，用巴斯德吸管小心謹(jǐn)慎的吹打卵母細(xì)胞2、3次，使卵丘顆粒細(xì)胞大部分脫離，僅留下2、3層顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞周圍，在透明質(zhì)酸酶中處理的時間≤30 s。將部分裸化的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到?jīng)_洗孔中，盡量少吸透明質(zhì)酸酶液；改用內(nèi)徑170μm的微吸管吹吸卵母細(xì)胞2、3次，盡量除去顆粒細(xì)胞；換用內(nèi)徑約140μm的微吸管在右上、右下2個沖洗孔中吹吸卵母細(xì)胞，最后將裸化的卵母細(xì)胞移入G-IVFplus培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司），置于37℃、6%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復(fù)以上操作直至所有卵母細(xì)胞完全裸化，取去除顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞成熟情況。①生發(fā)泡期：細(xì)胞核結(jié)構(gòu)尚未消失，卵胞漿內(nèi)可見核結(jié)構(gòu)；②第1次減數(shù)分裂中期：細(xì)胞核結(jié)構(gòu)消失，第1極體尚未排出；③第2次減數(shù)分裂中期（metaphaseⅡ, MⅡ）即成熟卵母細(xì)胞：細(xì)胞核結(jié)構(gòu)消失，第1極體已排出。挑選形態(tài)正常的精子對處于MⅡ期卵母細(xì)胞行ICSI，將注射后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至平衡好的G1 plus序貫培養(yǎng)液（瑞典Vitrolife公司）中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 受精及胚胎質(zhì)量評估

ICSI注射后18～20 h通過倒置顯微觀察原核，判定受精情況，以觀察到2個原核判定為正常受精。分別于ICSI注射后44和68 h觀察胚胎情況，根據(jù)胚胎碎片段多少及卵裂球均勻度等形態(tài)學(xué)指標(biāo)對胚胎進(jìn)行評分。1級：胚胎卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均勻、清晰沒有顆?，F(xiàn)象，碎片＜10%。2級：胚胎卵裂球大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，碎片10%～＜20%。3級：胚胎卵裂球大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則，胞質(zhì)可有明顯的顆粒現(xiàn)象，碎片20%～＜50%。4級：胚胎卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重的顆粒現(xiàn)象，碎片≥50%。其中細(xì)胞碎片＜10%、無其他異?，F(xiàn)象的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.5 胚胎移植及臨床妊娠結(jié)局判定

胚胎發(fā)育至第3天選取可利用胚胎進(jìn)行胚胎移植。臨床醫(yī)生在胚胎學(xué)家的協(xié)助下，將胚胎放置于距子宮底約0.5～1.0 cm處。移植術(shù)后第12～14天進(jìn)行隨訪，妊娠者繼續(xù)黃體支持治療，移植術(shù)后的第28～35天行B超檢查，觀察到胎心搏動確定為臨床妊娠。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本資料比較

兩組患者男女性年齡、體重指數(shù)（body mass index, BMI）、基礎(chǔ)竇卵泡（Antralfolliclecount, AFC）、不孕年限、基礎(chǔ)卵泡刺激素（basal follicle-stimulating hormone, bFSH）、基礎(chǔ)黃體生成素（basal luteinizing hormone, bLH）、基礎(chǔ)雌性激素（basal estrogen, bE2）及睪丸/附睪精I(xiàn)CSI比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

2.2 兩組患者助孕情況比較

兩組患者大卵泡數(shù)、獲卵率、促性腺激素（Gonadotrophin, Gn）使用天數(shù)、Gn總劑量、HCG日子宮內(nèi)膜厚度、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、臨床妊娠率、胚胎著床率及自然流產(chǎn)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者小卵泡數(shù)、平均獲卵數(shù)、ICSI受精率及卵裂率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組小卵胞數(shù)、平均獲卵數(shù)少于B組，ICSI受精率、卵裂率高于B組。見表2。

表1 兩組患者基本資料比較

表2 兩組患者助孕情況比較

3 討論

卵泡的成熟受到很多因素的影響，如Gn總劑量、Gn使用時間、促排卵方案的選擇、患者的身體條件差異、卵泡發(fā)育速度、扳機(jī)方案及扳機(jī)劑量等[6-7]。本研究中B組患者的平均獲卵數(shù)多于A組，因兩組患者大卵泡數(shù)及獲卵率無差異，而B組平均穿刺小卵泡數(shù)多于A組，分析B組獲卵數(shù)多于A組是由于B組患者平均穿刺小卵泡數(shù)多于A組所致。

臨床上理想的促排結(jié)果是所有目標(biāo)卵泡都達(dá)到同步狀態(tài)，在合適的時機(jī)獲取成熟的卵母細(xì)胞，但仍有部分卵泡發(fā)育遲緩或發(fā)育過快，致使卵泡發(fā)育不同步[8]。卵母細(xì)胞成熟應(yīng)為細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、卵丘細(xì)胞及透明帶的同步成熟，該成熟路徑經(jīng)歷復(fù)雜的生物學(xué)過程[9]。在日常工作中，胚胎學(xué)家只能通過顯微鏡觀察卵母細(xì)胞第1極體的釋放情況來判定其成熟與否，卻無法獲悉細(xì)胞質(zhì)是否也達(dá)到成熟狀態(tài)，而只有細(xì)胞質(zhì)完全成熟時才能提供充足的能量及優(yōu)質(zhì)的代謝環(huán)境，保證卵母細(xì)胞正常受精及分裂，為胚胎正常發(fā)育提供條件。本研究中在B組獲卵數(shù)多于A組的情況下，兩組患者的平均可利用胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)無差異，說明A組的卵母細(xì)胞利用率更高，但兩者的臨床妊娠率、著床率無差異。兩組患者自然流產(chǎn)率無差異，但由于移植周期數(shù)較少，且B組的流產(chǎn)率具有增高的趨勢，有待驗證是否由于卵母細(xì)胞成熟度過低從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育潛能不足。蔣益群[10]和付蕾等[11]的研究結(jié)果，表明ICSI不成熟卵母細(xì)胞比例過高可能對受精率、正常受精率、臨床妊娠率及種植率產(chǎn)生影響。結(jié)合本研究結(jié)果可以推測，隨著未成熟卵母細(xì)胞比例升高，整個獲取的卵母細(xì)胞成熟度偏低，對胚胎的發(fā)育潛能及臨床結(jié)局影響增加。

目前針對未成熟卵母細(xì)胞比例較高的患者采用卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)（in-vitro maturation, IVM）的治療方式，對未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVM以達(dá)到提高卵母細(xì)胞利用率的目的。通過IVM培養(yǎng)獲取的胚胎預(yù)后仍不理想，尤其是體外成熟的卵母細(xì)胞非整倍體增加，最好對通過IVM技術(shù)獲得的胚胎進(jìn)行種植前遺傳學(xué)診斷篩選[12-13]。

相信隨著促排方案的逐漸優(yōu)化和IVM技術(shù)的發(fā)展，卵母細(xì)胞成熟比例將會達(dá)到令人滿意水平，患者的卵母細(xì)胞利用率也會升高，從而獲取更多可利用胚胎以達(dá)到滿意的療效。