汪蕾 張秀霞 魯耀鵬 鄭佩華 冼健安

摘?要：為研究不同重金屬離子對蝦類血細胞的免疫抑制作用，凡納濱對蝦（Ltiopenaeus vannamei）血細胞在離體狀態(tài)下暴露于重金屬離子（Cd2+、Hg2+、Cu2+和Zn2+），濃度分別設(shè)置為10-3～10-9 M，在脅迫6 h后應用流式細胞術(shù)測定血細胞的吞噬活力。結(jié)果顯示，與對照組相比，濃度為10-3～10-5 M的Cd2+和Hg2+、10-3～10-4 M的Cu2+、10-3 M的Zn2+均顯著抑制了對蝦血細胞的吞噬活力;當濃度為10-3M時，Cd2+、Hg2+、Cu2+和Zn2+組的吞噬活力抑制率分別為79.6%，82.6%、68.1%和58.7%。這些結(jié)果表明，一定濃度的重金屬離子對蝦類血細胞吞噬活力具有免疫抑制作用，免疫抑制毒性強度依次為：Hg2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+，免疫毒性臨界濃度分別為：Cd2+和Hg2+ 10-5 M、Cu2+ 10-4 M、Zn2+ 10-3 M。

關(guān)鍵詞：重金屬;凡納濱對蝦（Ltiopenaeus vannamei）;血細胞;吞噬活力;免疫抑制

中圖分類號：X171

文獻標識碼：A

由于工業(yè)的迅猛發(fā)展，重金屬對水體環(huán)境的污染日趨嚴重。重金屬是典型的積累性污染物，具有較強的生物毒性和持久性，對水生動物的毒性極大，而且極易富集在水生動物體內(nèi)， 并可通過食物鏈進入并毒害人體，因此倍受研究者的關(guān)注。重金屬對蝦類毒性影響的研究主要集中在半致死濃度和酶類活性變化[1-3]。血細胞在蝦類免疫功能中起著十分重要的作用，吞噬作用是蝦類血細胞免疫防御的主要功能之一[4]，但以往由于技術(shù)限制等原因，重金屬對蝦類血細胞影響的研究仍甚少。

流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種快速、準確地檢測單個細胞功能的先進技術(shù)，此技術(shù)為細胞水平的研究提供了便捷、可靠的檢測平臺，在臨床研究中的應用十分廣泛，近年來已逐步應用到水產(chǎn)動物血細胞研究中[5-7]。本研究應用流式細胞術(shù)分析四種常見重金屬離子（Cd2+、Hg2+、Cu2+和Zn2+）對凡納濱對蝦離體血細胞吞噬活力的影響，探討不同重金屬離子對蝦類血細胞的免疫毒性。

1?材料和方法

1.1?材料與試劑

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）購于廣東省廣州市番禺區(qū)某養(yǎng)殖場，平均體重 ??（9.69±1.47）g，在實驗室[鹽度20‰，pH 7.9～8.0，溫度（24 ± 2）℃]暫養(yǎng)1周后，選取附肢完整、無病患、處于蛻皮間期的個體作為試驗用蝦。

黃綠色熒光微球（直徑1 μm）購自Molecular Probes，Invitrogen 公司，取微球原液，雙蒸水稀釋10倍得到微球工作液，微球濃度為3.6×109個/mL。其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2?血細胞懸液的制備

用2.5 mL一次性注射器吸取400 μL預冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g/L，檸檬酸鈉8 g/L，氯化鈉4.2 g/L，pH 7.5），然后從蝦的圍心腔抽取等量的血淋巴。取足夠的血淋巴后將其混合，用預冷的抗凝劑調(diào)整細胞濃度約為1×106個/mL，再分裝于離心管中。

1.3?離體重金屬脅迫

分別以CdCl2·2.5H2O、HgCl2、CuCl2和ZnCl2作為Cd2+、Hg2+、Cu2+和Zn2+的添加源，各重金屬離子的濃度均分別設(shè)置為10-3～10-9 M，不作處理的血細胞作為對照組。用抗凝劑配制濃度為10-1 M的各重金屬溶液，再依次逐步稀釋為10-2～10-7 M的工作液，分別加3 μL不同濃度的重金屬溶液至297 μL的血細胞懸液中，得到細胞懸液中重金屬的終濃度分別為10-3～10-9 M，對照組加入3 μL的抗凝劑。在室溫下孵育6 h。

1.4?流式細胞儀

實驗所用流式細胞儀是美國BD（Becton Dickinson）公司生產(chǎn)的FACSCalibur，激發(fā)光為488 nm。應用CellQuest軟件（Becton Dickinson I mmuno-cytometry Systems，San Jose，CA）進行實驗數(shù)據(jù)的獲取和分析。每個樣品的細胞獲取數(shù)為10 000個。

1.5?吞噬活力測定

以直徑為1 μm的黃綠色熒光微球作為被吞噬物測定血細胞的吞噬活力。血細胞經(jīng)重金屬處理6 h后，加入微球工作液7.5 μL，避光孵育60 min，200目篩網(wǎng)過濾后上機檢測。結(jié)果以細胞的熒光強度（FL1）為橫坐標，細胞數(shù)量為縱坐標的直方圖顯示。吞噬三個或以上熒光微球的細胞認為是吞噬陽性，通過Marker劃定陽性區(qū)域計算陽性細胞所占的比例，即為吞噬率。按以下公式計算吞噬活力抑制率：吞噬活力抑制率=（1-脅迫組吞噬率/對照組吞噬率）×100%。

1.6?統(tǒng)計分析

實驗重復三次，結(jié)果顯示為平均值 ± 標準差（Mean ± SD）。應用SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2?結(jié)果

2.1?Cd2+對血細胞吞噬活力的影響

10-3、10-4和10-5 ?M Cd2+顯著抑制血細胞的吞噬活力，吞噬活力分別降至對照組的20.4%（P<0.05）、34.7%（P<0.05）和60.3%（P<0.05）。10-6～10-9 M Cd2+組血細胞的吞噬活力與對照組之間沒有顯著性差異（P>0.05）。

2.2?Hg2+對血細胞吞噬活力的影響

10-3、10-4和10-5 M Hg2+顯著抑制血細胞的吞噬活力，吞噬活力分別降至對照組的17.4%（P<0.05）、17.6%（P<0.05）和45.4%（P<0.05）。10-6～10-9 M Hg2+組血細胞的吞噬活力與對照組之間差異不顯著（P>0.05）。

2.3?Cu2+對血細胞吞噬活力的影響

10-3和10-4 M Cu2+顯著抑制血細胞的吞噬活力，吞噬活力分別降至對照組的31.9%（P<0.05）和47.7%（P<0.05）。10-5～10-9 M Cu2+組血細胞的吞噬活力與對照組之間沒有顯著差異（P>0.05）。

2.4?Zn2+對血細胞吞噬活力的影響

10-3 M Zn2+顯著抑制血細胞的吞噬活力，吞噬活力降至對照組的41.3%（P<0.05）。10-4～10-9 M Zn2+組血細胞的吞噬活力與對照組之間沒有顯著差異（P>0.05）。

2.5?吞噬活力抑制率

按以下公式計算吞噬活力抑制率：（對照組吞噬率-脅迫組吞噬率）/對照組吞噬率×100%

不同濃度重金屬對吞噬活力抑制率如表1所示，吞噬活力抑制強度依次為：Hg2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+， Cd2+，Hg2+，Cu2+和Zn2+的吞噬抑制毒性臨界濃度分別為10-5 M，10-5 M，10-4 M和10-3 M。

3?討論

重金屬對蝦類具有較強的毒性，一些重金屬對蝦類的半致死濃度已有研究報道。Cd和Cu對體長6～9 mm、體重2.0～8.5 mg的凡納濱對蝦幼蝦的24 h LC50分別為2.22和4.50 mg/L，毒性Cd>Cu[8]。Cu和Zn對體長5～13 mm、體重1.50～10.83 mg的中國對蝦（Penaeus chinensis）仔蝦的24h LC50分別為3.74和5.12 mg/L，毒性Cu>Zn[2]。Cu、Zn、Cd和Hg對體長0.80～1.10 cm的斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）仔蝦的24 h LC50分別為7.978、8.904、4.365和0.329 6 mg/L，毒性依次為Hg>Cd>Cu>Zn[9]。Hg、Cd和Zn對的日本對蝦（Penaeus japonicus）仔蝦（P4）的24 h LC50分別為0.133、4.039和4.600 mg/L，毒性依次為Hg>Cd>Zn[10]。不同蝦類對重金屬的耐受能力不同，但總體而言，Hg和Cd作為非必需的重金屬元素，其毒性較強。在本研究中，依據(jù)臨界濃度可初步判斷Cd2+和Hg2+對吞噬活力的抑制毒性較強，進一步比較相同濃度下吞噬活力的抑制率，可發(fā)現(xiàn)Hg2+對吞噬活力的抑制強度大于Cd2+，由此可見，在這四種重金屬中，Hg2+的免疫抑制毒性最強，重金屬對血細胞吞噬活力的免疫抑制毒性強度依次為：Hg2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+。羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）的研究顯示，針對細胞活性，重金屬對血細胞的毒性強度依次為：Hg2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+，針對血細胞酯酶活力，Hg和Cd表現(xiàn)出較強的抑制性，Cu和Zn的抑制性相對較弱，表明Hg和Cd具有較強的免疫抑制毒性[6]，與本研究結(jié)果相似。

貝類是重要的水體環(huán)境質(zhì)量指示物種，重金屬對貝類吞噬活力影響的研究報道相對較多。Sauve等研究了Ag、Cd、Hg和Zn對多種海水和淡水雙殼貝類血細胞的影響，不同的物種表現(xiàn)出對重金屬的不同敏感性;在所有測試物種中，高濃度重金屬暴露均抑制了血細胞的吞噬活力，與本試驗結(jié)果一致;但在部分物種中，發(fā)現(xiàn)低濃度的有機Hg、無機Hg以及Zn可引起吞噬活力的提高，作者認為這是毒物興奮效應[11]，在本研究中沒有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。蛤（Mya arenaria）的研究結(jié)果也顯示，經(jīng)18 h的離體暴露，10-9和10-8M的低濃度的有機Hg、無機Hg以及Zn、Cd均刺激了血細胞的吞噬活力，而10-7M以上的濃度時，則表現(xiàn)出對吞噬活力的抑制性，依次為：ZnCl2

重金屬對吞噬活力的影響表現(xiàn)出明顯的劑量效應。以Cd2+為例，與對照組相比，10-9～10-6M對吞噬活力沒有顯著影響，達到10-5M及以上濃度時，吞噬活力顯著下降。不同重金屬的臨界濃度不同，Cd2+，Hg2+，Cu2+和Zn2+的吞噬抑制毒性臨界濃度分別為10-5 M，10-5 M，10-4 M和10-3 M。鮑魚（Haliotis tuberculata）的Zn2+的吞噬抑制毒性臨界濃度為1 000 μm（10-3 M）[13]，與凡納濱對蝦對Zn2+的敏感性一致。

本研究結(jié)果表明蝦類血細胞的吞噬活力對重金屬脅迫較敏感，可作為檢測重金屬免疫毒性的重要指標。重金屬對蝦類其它免疫功能的影響也有研究報道。低濃度的鎘（7.5 mg·L-1）對克氏原螯蝦肝胰腺和觸角腺中的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力起到了激活作用，而高濃度的鎘（30 mg·L-1）均顯著抑制了肝胰腺、觸角腺和鰓中的抗氧化酶活力[14]。一定濃度的重金屬會產(chǎn)生免疫毒性，降低蝦類的抵抗力，增加患病風險，因此在養(yǎng)殖過程中應重視養(yǎng)殖水體的重金屬含量。

參考文獻：

[1] 張亞娟，劉存歧，王軍霞，等.鎘對日本沼蝦的毒性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（29）：16268 -16270.

[2] 王安利，王維娜，李鐵水，等.銅、鋅、錳和鉻對中國對蝦仔蝦的急性致毒及相互關(guān)系的研究[J].海洋學報，1992，14（4）：134-139.

[3] 王維娜，王安利，孫儒泳.水環(huán)境中的銅鋅鐵鈷離子對日本沼蝦消化酶和堿性磷酸酶的影響[J].動物學報，2001，47（?？?2-77.

[4] Johansson M W，Keyser P，Sritunyalucksana K，et al.Crustacean haemocytes and haematopoiesis[J].Aquaculture，2000，191：45-52.

[5] 潘訓彬，張秀霞，冼健安.急性氨氮脅迫對紅螯螯蝦血細胞凋亡的影響[J].河北漁業(yè)，2017，（11）：4-7，28.

[6] 郭慧，張秀霞，鄭佩華，等.重金屬對羅氏沼蝦血細胞活性和酯酶活力的影響[J].中國水產(chǎn)科學，2017，24（5）：1123-1130.

[7] 汪蕾，張秀霞，冼健安.硫化物脅迫對凡納濱對蝦血細胞的毒性影響[J].水生態(tài)學雜志，2017，38（3）：97-102.

[8] 姚慶禎，臧維玲，戴習林，等.銅、鎘、敵敵畏和甲胺磷對南美白對蝦幼蝦的急性致毒及相互關(guān)系[J].上海水產(chǎn)大學學報，2003，12（2）：117-122.

[9] 鄒棟梁，高淑英.銅、鋅、鎘、汞、錳和鉻對斑節(jié)對蝦仔蝦急性致毒的研究[J].海洋環(huán)境科學，1994，13（3）：13-18.

[10] 高淑英，鄒棟梁，厲紅梅.汞、鎘、鋅和錳對日本對蝦仔蝦的急性毒性[J].海洋通報，1999，18（2）：93-96.

[11] Sauve S，Brousseau P，Pellerin J，et al.Phagocytic activity of marine and freshwater bivalves：in vitro exposure of hemocytes to metals（Ag，Cd，Hg and Zn）[J].Aquatic Toxicology，2002，58：189-200.

[12] Brousseau P，Pellerin J，Morin Y，et al.Flow cytometry as a tool to monitor the disturbance of phagocytosis in the clam Mya arenaria hemocytes following in vitro exposure to heavy metals[J].Toxicology，2000，142：145-156.

[13] Mottin E，Caplat C，Mahaut M L，et al.Effect of in vitro exposure to zinc on immunological parameters of haemocytes from the marine gastropod Haliotis tuberculata[J].Fish & Shellfish I mmunology，2010，29：846-853.

[14] 呼光富，李忠，梁宏偉，等.鎘對克氏原螯蝦肝胰腺觸角腺及鰓中SOD和CAT活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2009，28（9）：1806-1811.