何曉明，余鵬飛，陳 可，趙月鈞，沈雄雅，胡永東，倪娟楨

（綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江杭州31052）

隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，鎮(zhèn)靜劑和β-受體激動(dòng)劑作為促生長劑被廣泛用于動(dòng)物養(yǎng)殖過程中。鎮(zhèn)靜劑是一類對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用的藥物，具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、肌肉松弛和安定作用，在飼養(yǎng)過程中將此類藥物添加至飼料中以達(dá)到快速催肥、縮短出欄時(shí)間的目的［1］。β-受體激動(dòng)劑，俗稱“瘦肉精”，可以選擇性地作用于腎上腺素，增加蛋白質(zhì)合成、增強(qiáng)脂肪分解代謝，顯著提高酮體瘦肉率［2］。研究表明，鎮(zhèn)靜劑和β-受體激動(dòng)劑可通過飼料進(jìn)入到動(dòng)物組織，長期食用會(huì)對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)等造成不良影響［3-4］。我國原農(nóng)業(yè)部176號(hào)、193號(hào)公告中明確規(guī)定嚴(yán)禁在動(dòng)物飼養(yǎng)過程中使用該類藥物。因此，建立一種快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)飼料中多種鎮(zhèn)靜劑和β-受體激動(dòng)劑的方法，對(duì)保障畜產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有重要意義。

迄今為止，鎮(zhèn)靜劑和β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)方法主要包括：酶聯(lián)免疫法（ELISA）［5］、氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）［6-7］、液相色譜法（HPLC）［8］和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）［9-10］。ELISA法和HPLC法方法靈敏度較低，選擇性較差，不能滿足痕量檢測(cè)的要求。GC-MS法通常需要衍生化才能進(jìn)行測(cè)定，費(fèi)時(shí)較長。HPLC-MS/MS法因其具有靈敏度高、選擇性和抗干擾能力強(qiáng)，成為最常用的檢測(cè)方法。

由于鎮(zhèn)靜劑和β-受體激動(dòng)劑在飼料中一般以痕量存在，且飼料基質(zhì)復(fù)雜，易對(duì)分析造成干擾，在進(jìn)行檢測(cè)分析前需進(jìn)行富集和凈化。目前，飼料樣品殘留的前處理方法主要是固相萃取技術(shù)（SPE），存在如操作繁瑣、處理時(shí)間長、成本高等問題。相比之下，基于磁性石墨烯的磁性固相萃取技術(shù)因結(jié)合了磁性萃取操作簡單、傳質(zhì)迅速、材料可回收利用和石墨烯具有巨大的比表面積和對(duì)有機(jī)化合物產(chǎn)生強(qiáng)大的π-π相互作用等特點(diǎn)，目前已被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域［11-13］。然而，石墨烯作為一種疏水性的碳基納米材料，在萃取過程中容易團(tuán)聚，極大地阻礙了其在前處理技術(shù)中的應(yīng)用。

β-環(huán)糊精（β-CD）是由7個(gè)D-（+）吡喃葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵首尾相連而成環(huán)形低聚糖，具有一個(gè)環(huán)外親水的疏水腔，能夠選擇性吸附各類客體分子在疏水空腔內(nèi)形成穩(wěn)定的主客體絡(luò)合物。利用β-環(huán)糊精修飾磁性石墨烯制備納米復(fù)合材料，保留了磁性石墨烯和β-環(huán)糊精兩者的自身優(yōu)點(diǎn)，也可以增加石墨烯的親水性和分散性，避免石墨烯由于π-π 作用和范德華力作用而團(tuán)聚的現(xiàn)象，提高萃取效率［14-17］。

本研究利用改進(jìn)的磁固相萃取對(duì)飼料進(jìn)行前處理，自制了一種新型的吸附劑（Fe3O4-G/β-CD）對(duì)飼料中的6種鎮(zhèn)靜劑和5種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行萃取，同時(shí)結(jié)合HPLC-MS/MS對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。本方法具有較高的靈敏度及精密度、較短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間、較低的分析成本等特點(diǎn)，能滿足目前的檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-MS/MS 8050三重四級(jí)桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司）；ST16R高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）；DZF-0632真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

β-受體激動(dòng)劑類：克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、西馬特羅、特布他林；鎮(zhèn)靜劑類：氯丙嗪、地西泮、艾司唑侖、咪達(dá)唑侖、奧沙西泮、硝西泮純度均大于95%，購于 Dr.Ehrenstorfer公司。

磁性石墨烯Fe3O4-G（筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制［17］）；甲酸、乙腈和甲醇（HPLC級(jí)，美國Thermo公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q（美國Millipore公司）超純水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用甲醇配制成濃度為100 mg/L的儲(chǔ)備液，置于-18℃冰箱保存，分別吸取100μL配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，采用甲醇定容，配制成1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用時(shí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 磁性石墨烯/β-環(huán)糊精復(fù)合材料（Fe3O4-G/β-CD）的制備

Fe3O4-G/β-CD參照文獻(xiàn)［17］采用原位沉淀法制得。取磁性石墨烯Fe3O4-G 600 mg分散于150 mL水中，超聲1 h，加入2.5 mL濃氨水，室溫下攪拌10 min，加入4.8 gβ-環(huán)糊精，于60℃水浴中攪拌5 h。待溶液冷卻至室溫，用乙醇和水洗滌數(shù)次去除過量的β-環(huán)糊精，用磁鐵分離，60℃下真空干燥24 h后得到Fe3O4-G/β-CD。

1.4 樣品前處理

稱取2.0 g均質(zhì)處理好的飼料樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL 80%乙腈-水溶液，渦旋混勻，超聲提取5 min后，4℃下以4 000 r/min離心3 min，取上清液于50 mL雞心瓶中。殘?jiān)?0 mL 80%乙腈-水溶液重復(fù)提取1次，合并2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用10 mL水復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。

稱取60 mg Fe3O4-G/β-CD加入到上述離心管中，40℃下超聲6 min，用磁鐵分離固液兩相。棄去上清液，加入3 mL乙腈，渦旋2 min，磁性分離后將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，重復(fù)解析1次，合并收集2次解析液，40℃下氮吹近干。用1.0 mL甲醇復(fù)溶，過0.22μm 有機(jī)相濾膜，供HPLC-MS/MS測(cè)定。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.8μm）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：3μL；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸甲醇溶液；梯度順序：0～1.0 min，7% B；1.0～3.0 min，7%～25% B；3.0～5.0 min，25%～95% B；5.0～7.0 min，95% B；7.0～8.0 min，95%～7% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）：正離子模式；溫度：400℃，毛細(xì)管電壓：4 000 V；霧化氣流量：3.0 L/min；加熱氣流量：10.0 L/min；定性與定量離子對(duì)、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 11種待測(cè)物的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)待測(cè)物特點(diǎn)，本研究選用ESI正離子模式作為其離子化方式。分別配制質(zhì)量濃度為200μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用一級(jí)質(zhì)譜全掃描的方式獲得各待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子，再對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，確定每個(gè)待測(cè)物的定量、定性離子對(duì)，最后在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)一步優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)。所選擇的母離子、子離子和碰撞能量等參數(shù)見表1。

本研究考察了ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.8μm）、Ultimate UHPLC AQ-C18（2.1×100 mm，1.8μm）和Kinetex@2.6μm XB-C18（2.1×100 mm，2.6μm）3種不同類型的色譜柱對(duì)11種待測(cè)物的靈敏度和分離效果。結(jié)果表明，3種色譜柱的靈敏度均能滿足要求，但采用ACQUITY UPLC HSS T3柱時(shí)，待測(cè)物譜峰峰形較好，因此選用ACQUITY UPLC HSST3色譜柱。

ESI電離是在溶液狀態(tài)下完成的，因此本研究進(jìn)一步對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化。文獻(xiàn)表明，使用甲醇或在水相中添加0.1% 甲酸均能使待測(cè)物獲得較好的分離度和響應(yīng)強(qiáng)度［9-10］。本研究在此基礎(chǔ)上考察了在甲醇中加入0.1%甲酸對(duì)11種待測(cè)物分離及峰型的影響。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇中加入0.1%甲酸后，雖對(duì)待測(cè)物響應(yīng)強(qiáng)度影響不大，但峰型和重復(fù)性有明顯改善。這可能是甲醇和水相中酸濃度相同，保證了在梯度洗脫過程中，2種流動(dòng)相混合時(shí)，pH值恒定，容易平衡梯度。因此本研究選擇0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。11種化合物的總離子流色譜圖見圖1。

2.2 提取條件優(yōu)化

文獻(xiàn)顯示，甲醇、乙酸乙酯和乙腈是獸藥提取的的常用試劑，由于飼料中蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)是主要的基質(zhì)干擾物，所以選擇了有更好的蛋白沉淀作用的乙腈作為提取試劑。

飼料的水分含量較低，直接用有機(jī)溶劑提取效果不佳。為改善提取效果，在提取時(shí)加入一定量水用以分散樣品，增加有機(jī)試劑與樣品的接觸面積，從而提高提取效率。本研究進(jìn)一步對(duì)體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%的乙腈-水溶液和純乙腈5種提取試劑進(jìn)行比較。結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑中乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，提取效率最高，通過2次分步提取，11種待測(cè)物的回收率均大于85%。

2.3 萃取條件優(yōu)化

為得到11種待測(cè)物的最佳萃取條件，本研究分別考察了吸附劑用量、pH值、萃取溫度、萃取時(shí)間、洗脫溶劑的種類及用量、洗脫時(shí)間等因素對(duì)萃取效果的影響。

2.3.1 吸附劑用量 吸附劑的用量是影響萃取效率的重要因素，本研究分別對(duì)20、40、60、80、100 mg的Fe3O4-G/β-CD用量進(jìn)行了考察，由圖2-A可知，當(dāng)Fe3O4-G/β-CD用量為20～60 mg時(shí)，萃取效率隨Fe3O4-G/β-CD用量的增加而明顯提高；繼續(xù)增加用量萃取效率反而有降低趨勢(shì)，可能是過多的Fe3O4-G/β-CD導(dǎo)致待測(cè)物洗脫不完全，因此選擇吸附劑的用量為60 mg。

2.3.2 pH值 pH值是影響吸附劑和待測(cè)物物化性質(zhì)的重要因素，本研究考察了pH值在2～10時(shí)對(duì)11種待測(cè)物的萃取效率的影響，由圖2-B可知，pH值在2～8時(shí)，萃取效率隨著pH值的增高而增大，這是由于11種待測(cè)物均為堿性化合物，酸度系數(shù)（pKa）＞7，堿性條件下非離子狀態(tài)存在，易與吸附劑吸附。pH值繼續(xù)升高，回收率有所下降，產(chǎn)生這現(xiàn)象的原因可能是活性基團(tuán)容易在強(qiáng)堿條件下電離，影響了待測(cè)物與吸附劑之間的相互作用，因此選擇pH值為8。

2.3.3 萃取溫度 溫度可以改變待測(cè)物從樣品擴(kuò)散到吸附劑的傳質(zhì)速率，選擇適當(dāng)?shù)臏囟扔欣诖郎y(cè)物的萃取，考察了萃取溫度分別為20、30、40、50、60℃時(shí)的萃取效果，由圖2-C可知，萃取效率隨著溫度的升高而逐漸增加，在40℃時(shí)萃取效率達(dá)到最大；溫度繼續(xù)升高萃取效率反而有所下降，可能是隨著溫度升高待測(cè)物在吸附劑和樣品間分配系數(shù)降低的原因，因此最終選擇萃取溫度為40℃。

2.3.4 萃取時(shí)間 固相萃取本質(zhì)是待測(cè)物在提取試劑與吸附劑之間達(dá)到一個(gè)分配平衡，萃取效率與萃取時(shí)間有著直接的關(guān)系。選擇適當(dāng)?shù)妮腿r(shí)間不僅能提高萃取效果，還可以縮短萃取時(shí)間。本研究對(duì)萃取時(shí)間為2、4、6、8、10 min時(shí)的萃取效率進(jìn)行比較，由圖2-D可知，隨著萃取時(shí)間的延長，萃取效率逐漸增大，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到6 min后萃取效率基本穩(wěn)定，吸附已經(jīng)飽和，達(dá)到萃取動(dòng)態(tài)平衡。因此本研究選擇萃取時(shí)間為6 min。

2.3.5 洗脫溶劑的種類及體積 洗脫溶劑的種類是影響洗脫效率的重要因素，為了將待測(cè)物盡可能地從Fe3O4-G/β-CD中洗脫，本研究察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和三氯甲烷4種試劑的洗脫效果，由圖2-E可知，采用乙腈作為洗脫溶劑時(shí)對(duì)11種待測(cè)物的洗脫效率最好，因此選擇乙腈作為洗脫溶劑。進(jìn)一步考察了洗脫溶劑用量1、2、3、4、5 mL對(duì)洗脫效率的影響，由圖2-F可知，當(dāng)洗脫溶劑用量為3 mL時(shí)，11種待測(cè)物的回收率均大于85%，繼續(xù)增加洗脫溶劑用量，回收率無明顯變化，因此選擇3 mL乙腈作為洗脫溶劑。

2.3.6 洗脫時(shí)間 洗脫時(shí)間也是影響洗脫效率的一個(gè)重要因素，為更高效地將待測(cè)物從Fe3O4-G/β-CD中洗脫，考察洗脫時(shí)間1、2、3、4、5 min時(shí)的洗脫效果，由圖2-G可知，2 min就足以完全洗脫待測(cè)物。因此，選擇洗脫時(shí)間為2 min。

2.3.7 Fe3O4-G/β-CD的重復(fù)利用 為考察Fe3O4-G/β-CD的重復(fù)利用性能，每次試驗(yàn)后，采用乙腈洗滌3次，60℃烘干，再重新按“1.5”節(jié)進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，當(dāng)循環(huán)使用5次后，待測(cè)物的回收率仍在80%以上，說明Fe3O4-G/β-CD具有良好的穩(wěn)定性和較高的重復(fù)利用率。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析中普遍存在，是基質(zhì)成分和待測(cè)物在電噴霧離子源進(jìn)行離子化時(shí)相互競爭所致。為評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，分別配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線（添加含量為1、5、10、20、50、100μg/L）及對(duì)應(yīng)的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值評(píng)價(jià)11種待測(cè)物的基質(zhì)效應(yīng)。若斜率在0.8～1.2之間，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯。結(jié)果表明，11種待測(cè)物斜率在0.833～0.905之間，說明本研究的前處理方法可以有效消除飼料中蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)等引起的基質(zhì)效應(yīng)。但為了獲得更加準(zhǔn)確的定量結(jié)果，本研究仍采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 線性范圍和定量限

配制6個(gè)水平的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出11種待測(cè)物線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（表2）。同時(shí)，根據(jù)10倍信噪比（S/N）確定待測(cè)物方法定量限（LOQ），表明11種待測(cè)物的線性關(guān)系良好，定量限為μg/kg數(shù)量級(jí)。

表2 11種待測(cè)物的線性方程、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.6 回收率與精密度

在空白配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混飼料中分別添加5、10、25μg/kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.4”節(jié)和“1.5”節(jié)前處理方法及測(cè)定條件重復(fù)測(cè)定6次。由表3可知，11種待測(cè)物平均回收率為84.7%～96.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～10.8%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)［18-19］和文獻(xiàn)［9-10］相比，本方法在保證靈敏度的前提下，操作更加簡便，同時(shí)將檢測(cè)周期縮短至1 h，更適合大批量樣品的檢測(cè)。

2.7 實(shí)際樣品分析

用本方法對(duì)日常送檢的配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混飼料各10份進(jìn)行分析，均無藥物殘留檢出。

3 結(jié)論

本研究以自制的β-環(huán)糊精磁性石墨烯納米材料為新型吸附劑，采用磁固相萃取技術(shù)，并結(jié)合HPLC-MS/MS建立了可同時(shí)測(cè)定飼料中6種鎮(zhèn)靜劑和5種β-受體激動(dòng)劑的快速檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確度好、靈敏度高、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，且有效克服了基質(zhì)干擾的問題，可以滿足日常飼料樣品快速檢測(cè)的需求，為監(jiān)管部門提供技術(shù)支撐。

表3 空白樣品中11種待測(cè)物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）