明悉引物設(shè)計(jì) 參透PCR技術(shù)

孫 娟

(首都師范大學(xué)附屬回龍觀育新學(xué)校 北京 102208)

關(guān)鍵字 PCR 引物設(shè)計(jì) 題型解析

PCR(Polymerase Chain Reaction)是一種人工合成DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR技術(shù)是高中生物學(xué)選修3《現(xiàn)代生物科技專題》模塊的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一，其基本原理和過程如圖1所示。

圖1 PCR原理反應(yīng)示意圖[1]

在教學(xué)實(shí)踐中，教師一般采用動(dòng)畫演示或者繪圖的方式闡釋PCR的原理和過程。但是，學(xué)生在解決PCR實(shí)際問題時(shí)仍然會(huì)有很多困惑，其中最為突出的問題是PCR的引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)是PCR的核心，學(xué)生既可以通過Primer Premier等軟件去設(shè)計(jì)引物，也可以通過考題去明悉引物設(shè)計(jì)的意義，從而深刻理解PCR的原理和過程。

PCR除了能完成常規(guī)的DNA擴(kuò)增，還可以通過巧妙的引物設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)突變、添加酶切位點(diǎn)、特定片段的拼接(搭橋PCR)等功能。本文結(jié)合具體題目明悉引物設(shè)計(jì)的多種方法，從而對不同的PCR進(jìn)行深度解析。

1 常規(guī)PCR的引物設(shè)計(jì)和選擇

PCR的引物包括兩條，這兩條引物能夠分別與待擴(kuò)增片段(序列已知)的兩條鏈堿基互補(bǔ)配對，而DNA的兩條新鏈延伸方向相反，這與DNA的空間結(jié)構(gòu)為反向平行雙螺旋的特點(diǎn)是一致的。在常規(guī)的引物設(shè)計(jì)中，均應(yīng)包括兩條引物，且位于待擴(kuò)增片段的兩端，引物方向均為5′→3′。擴(kuò)增目的不同，選擇的引物也會(huì)不同，但基本原則相同。

例1 (2014年·北京30題)(2)a基因是通過將T-DNA插入到A基因中獲得的，用PCR法確定T-DNA插入位置時(shí)，應(yīng)從圖2中選擇的引物組合是。(參考答案： II、 III)

圖2 鏈?zhǔn)紻NA引物選擇題型注： Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ為引物

解析： 此題目中PCR是為了確認(rèn)插入位置，故需要將T-DNA與A基因連接的位置擴(kuò)增出來，引物應(yīng)分別與上下兩條鏈互補(bǔ)，圖2給出了引物的方向(延伸方向?yàn)?′→3′)，所以，只能選擇II、 III。

例2 (2011年·北京31題)(6)根據(jù)T-DNA的已知序列，利用PCR技術(shù)可以擴(kuò)增出被插入的基因片段。其過程是： 提取突變體植株的DNA，用限制酶處理后，再用將獲得的DNA片段連接成環(huán)(圖3)，以此為模板，從圖中A、 B、 C、 D四種單鏈DNA片斷中選取作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到的片斷將用于獲取該基因的全序列信息。(參考答案： DNA連接酶；B、 C)

圖3 環(huán)狀DNA引物選擇題型注： A、 B、 C、 D表示能與相應(yīng)T-DNA鏈互補(bǔ)、長度相等的單鏈DNA片段；箭頭指示DNA合成方向

解析： 此題通過PCR可以獲取未知基因的全部序列信息，因此，需要將“被插入的基因片段”全部擴(kuò)增出來，引物應(yīng)位于其兩端，且分別于兩條鏈互補(bǔ)。圖3給出了A的方向，根據(jù)DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可知，C與A方向相同，B、 D的方向與A相反，選用A、 D能夠擴(kuò)增出T-DNA序列，選用B、 C才能擴(kuò)增出包含“被插入的基因片段”的序列信息，故選擇B、 C。

例3 (北京·西城2017.1，26題)(2)②利用PCR技術(shù)從cDNA文庫中獲取AtNX1基因(基因序列未知)，需根據(jù)AtNX1蛋白氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，引物的序列可以有多種，原因是。在PCR體系中需加入其中的引物(填“全部”或“任意1種”或“其中2種”)。(參考答案： 全部)

解析： 此題的難度較例1、2有所增加，考查了引物與模板堿基互補(bǔ)配對的特點(diǎn)，由于密碼子具有簡并性(一種氨基酸對應(yīng)多種密碼子)，并不能確定哪一種引物可以和未知序列堿基互補(bǔ)配對，因此，需要將全部引物加入，配對成功的引物可以完成PCR擴(kuò)增過程，其他引物因無法配對不形成干擾。

2 基因定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)

例4 (北京·海淀2017.11，34題)(2)蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對人體沒有影響。檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的蛋白A基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)效率很低，研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對引物(引物B和C中都替換了一個(gè)堿基)，并按圖4方式依次進(jìn)行4次PCR擴(kuò)增，以得到新的蛋白A基因。①這是一種定點(diǎn)的技術(shù)。②圖4所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇圖中所示的引物？請?zhí)顚懸韵卤砀?若選用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“×”)。(參考答案： (2)① 基因突變 ② 如下表所示)

引物A引物B引物C引物DPCR1√√××PCR2××√√PCR3××××PCR4√××√

解析： 此題的引物設(shè)計(jì)與以往都不同，B和C中都替換了一個(gè)堿基，從圖4分析可知，這兩個(gè)引物位于基因的相同位置，替換的堿基應(yīng)該能夠互補(bǔ)配對，如此便可以實(shí)現(xiàn)將基因A的特定位置替換為新的堿基對。因此，屬于一種基因突變的技術(shù)。后續(xù)的PCR過程就是為了完成基因的定點(diǎn)突變，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，學(xué)生可以從PCR1、 PCR2的圖示中選出引物A&B、 C&D。

PCR1、 PCR2的產(chǎn)物混合后退火，由圖4可見，引物B、C所在位置的序列可以堿基互補(bǔ)配對結(jié)合在一起，從而使蛋白A基因的兩條鏈以局部配對的方式結(jié)合，并彼此充當(dāng)引物(不需要額外添加引物)，完成5′→3′方向的延伸過程。因此，PCR3的結(jié)果是在替換了一個(gè)堿基的位置發(fā)生基因的定點(diǎn)突變。PCR4過程是為了獲取更多新的蛋白A基因，選取的引物應(yīng)位于其兩端，根據(jù)擴(kuò)增方向?yàn)?′→3′的原則，選擇的引物應(yīng)該是A和D。

圖4 基因定點(diǎn)突變原理示意圖 注： 圖中“”為堿基序列變化點(diǎn)

此題進(jìn)行PCR擴(kuò)增的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)某一個(gè)特定位置堿基對的替換，因此，需要根據(jù)目的基因的序列進(jìn)行分段PCR，最后再將兩段拼接起來，是一種比較傳統(tǒng)和實(shí)用的體外基因突變方法。隨著科技的發(fā)展，CRISPR-Cas9定點(diǎn)突變技術(shù)應(yīng)用更為廣泛，其原理見例5。

例5 (北京·海淀2016.5)敲除基因時(shí)，sgRNA與紅眼基因B的部分序列互補(bǔ)配對，細(xì)胞內(nèi)的Cas9酶在配對區(qū)域定點(diǎn)剪切，引起紅眼基因B發(fā)生堿基對，導(dǎo)致基因突變。該過程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA的作用類似于酶的作用，敲除后需要酶對DNA上的切口進(jìn)行修復(fù)。(參考答案： 缺失，限制，DNA連接)

圖5 CRISPR-Cas9技術(shù)原理圖

解析： 此題中，基因突變是通過sgRNA(small guide RNA，向?qū)蛄?實(shí)現(xiàn)的，sgRNA是人工設(shè)計(jì)的能夠與特定基因堿基互補(bǔ)配對的一小段RNA，當(dāng)其與目的基因結(jié)合后，Cas9酶就可以對目的基因進(jìn)行剪切，從而實(shí)現(xiàn)基因突變。

3 搭橋PCR與酶切位點(diǎn)的添加

例6 (北京·海淀2017.5，30題)(3)為研究基因A與四膜蟲的耐藥性是否有關(guān)，科研人員提取耐藥個(gè)體的DNA，用圖6所示的引物組合，分別擴(kuò)增A基因的A1片段、A3片段。

圖6 添加特定序列的PCR引物選擇注： 引物Ⅱ、 Ⅲ上的x、 y片段分別與N基因兩端互補(bǔ)配對

① 據(jù)圖6分析，用引物Ⅰ、 Ⅱ組合擴(kuò)增后，得到的絕大部分DNA片段是下圖中的。

② 將大量N基因片段與擴(kuò)增得到的A1片段、A3片段置于PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，得到的絕大多數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物是。(參考答案： (3)①d ②A1-N-A3)

解析： 此題的難點(diǎn)在于對PCR過程的分析，引物與模板鏈結(jié)合后，在Taq酶的作用下開始延伸，延伸的終點(diǎn)為模板鏈的終點(diǎn)(圖7)，第二輪擴(kuò)增后會(huì)出現(xiàn)“A1-x”序列，之后以2n擴(kuò)增，同時(shí)，以“A1-A2-A3”為模板進(jìn)行的擴(kuò)增在兩輪后都會(huì)產(chǎn)生“A1+x”片段，最終反應(yīng)體系中“A1-x”數(shù)量最多。同理，用III和IV擴(kuò)增出的應(yīng)為“y-A3”。

在N基因片段與擴(kuò)增得到的A1片段、A3片段的PCR反應(yīng)體系中，通過引物中x、 y片段局部配對的方式，兩條鏈可以結(jié)合并分別充當(dāng)彼此的引物，不再需要額外添加引物，其原理與例4的PCR3過程(圖4)相同。最終，通過搭橋PCR的方式實(shí)現(xiàn)“A1-N-A3”的拼接。

圖7 添加特定序列的PCR原理

4 簡并引物與突變位點(diǎn)確認(rèn)

例7 原創(chuàng)試題(節(jié)選)： 采用電擊轉(zhuǎn)化法將已知序列的外源DNA片段隨機(jī)插入野生型衣藻基因組中可獲得衣藻的鞭毛突變體，為進(jìn)一步確定突變體衣藻的突變基因，設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)(圖8)。若要確定外源DNA片段插入X基因的位置，需要選用引物及，分別擴(kuò)增出對應(yīng)序列，再通過測序和序列比對確定外源DNA片段插入X基因的a和b兩個(gè)位置。(參考答案： 1、3；2、4)

圖8 確認(rèn)突變位點(diǎn)的PCR引物選擇

解析： 此題需要找出外源DNA在A基因中的插入位點(diǎn)a、 b，因此，需要分別擴(kuò)增出包含a、 b兩個(gè)位點(diǎn)的序列，按照圖示應(yīng)選擇1、3擴(kuò)增出左側(cè)片段，選擇2、4擴(kuò)增出右側(cè)片段，測序后即可得知插入位點(diǎn)的序列。

此項(xiàng)PCR技術(shù)中的X基因序列是未知的，因此，并不能設(shè)計(jì)出與其堿基互補(bǔ)配對的引物3、4。在實(shí)際操作中，通常會(huì)通過查詢衣藻的全基因組序列找出其較為保守的一些序列，從而設(shè)計(jì)出一些能夠與多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的簡并引物(degenerated primers)，在PCR過程中，同時(shí)加入簡并引物3、4和1、2(與已知序列結(jié)合)，通過調(diào)整退火溫度，促使3、4引物與多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生特異或非特異結(jié)合，其中有一部分即為包含a或者b的產(chǎn)物。之后，通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，使不同長度的PCR產(chǎn)物分離開，選擇含量較高的(條帶較寬)的位置切下膠塊進(jìn)行DNA回收，測序后通過與外源DNA序列比對得出a、 b所在具體位點(diǎn)。