張義全，梁琪，趙春燕，吳晗，宋雪梅，張炎

(甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

牦牛乳功能性營養(yǎng)成分(氨基酸、酪蛋白和免疫球蛋白)含量較高，是一種優(yōu)質的乳品[1-2]，也是干酪加工的優(yōu)質乳源[3].凝乳是干酪生產的關鍵環(huán)節(jié)之一.干酪成熟過程中伴隨著復雜的生物化學變化，酸凝與酶凝是兩種不同的促進凝膠形成的方法[4]，會影響干酪的質構特性和風味.傳統(tǒng)干酪的生產多是以酶凝方式為主，需要動物性凝乳酶，如小牛皺胃酶等，但這些酶資源短缺，價格昂貴.酸凝干酪可以不添加凝乳酶，通過直接添加酸化劑使牛乳發(fā)生凝結而制得干酪，其生產工藝簡單，成本較低，風味清新，適合中國人的口味[5].

Breene等[6]首次通過酸凝法生產Mozzarella干酪.Quarne等[7]研究了不同酸化劑和凝乳酶對農家干酪的出品率、感官品質以及蛋白質降解的影響.Ralph[8]首次通過感官分析評價了酸凝Mozzarella干酪.馬玲等[9]和馬楊等[10]研究了酸凝干酪成熟期間理化特性的變化.綜上所述，國內外對酸凝干酪品質特性的研究較多，但鮮見酸凝牦牛乳硬質干酪的研究報道，并且酸凝和酶凝牦牛乳硬干酪的對比性研究也較少.

本試驗以酶凝和酸凝牦牛乳硬質干酪為研究對象，通過對其感官品質、質構特性、理化特性以及苦味肽分子量分布的測定，揭示不同凝乳方式(酶凝和酸凝)的牦牛乳硬質干酪在成熟過程中質量特性差異，對影響酸凝和酶凝干酪成熟期品質的因素進行系統(tǒng)分析，旨為改進牦牛乳硬質干酪成熟期品質提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牦牛乳：采自甘肅省天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉(xiāng)；混合發(fā)酵劑：嗜熱發(fā)酵劑(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌)與嗜溫發(fā)酵劑(乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種)按1∶1組成，均來自丹麥丹尼斯克公司；微生物凝乳酶：酶活為1.95×104SU/g，甘肅華羚生物技術研究中心；Sephadex G-25葡聚糖凝膠(色譜純)美國GE公司；細胞色素C、抑肽酶、氰鈷胺素VB12、氧化性谷胱甘肽均為標準品.

1.2 儀器與設備

Scientz-ND真空冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SBS-100數(shù)控計滴自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠)；SBS-100蛋白純化層析系統(tǒng)和組分收集器(上海青浦滬西儀器廠)；TA.XT Express質構儀(美國FTC公司).

1.3 方法

1.3.1 干酪的制作 新鮮牦牛乳→過濾→檢驗→巴氏殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻(35 ℃)→添加發(fā)酵劑(0.006 25 g/L)→添加CaCl2(0.3 g/L)→添加凝乳酶(100.9 U/mL)/添加乳酸(切割pH值達到4.6)→35 ℃凝乳→切割→45 ℃二次加熱→排乳清→攪拌、加鹽(用量為凝塊的2%)→35 ℃堆釀(30 min)→壓榨成型(4～5 h)→真空包裝→成熟[11].

1.3.2 操作要點 1)新鮮牦牛乳：選用理化、微生物指標合格，無抗生素的牦牛鮮乳.2)殺菌：采用巴氏殺菌，在62～65 ℃保溫殺菌30 min.

3)添加發(fā)酵劑：將殺菌乳冷卻至35 ℃左右，添加1%食鹽水，配制成相應濃度的發(fā)酵劑，使原料乳產酸.

4)添加氯化鈣：在干酪生產過程中添加0.3 g/L氯化鈣，可提高干酪凝塊的質構，并抑制原料乳中的雜菌.

5)添加凝乳酶/乳酸：加入氯化鈣10 min以后，向酶凝干酪中添加由1%的食鹽水溶解，在35 ℃活化30 min的微生物凝乳酶；向酸凝干酪中添加適宜濃度的乳酸，使pH值達到4.6，促進凝乳.

6)凝塊切割、攪拌和加熱：凝塊達到一定硬度后，切割成立方體小塊，輕微攪拌，使凝塊顆粒懸浮在乳清中，使乳清分離，加熱可使凝塊顆粒稍微收縮，有利于乳清從凝塊中排出.

7)加鹽：待排出乳清后，向其中加入2%的食鹽.

8)堆釀：為提高干酪質地，堆釀2 h.

9)壓榨：促使干酪中的乳清進一步排除，并讓干酪具備一定的組織狀態(tài).

10)真空包裝：干酪成品用LDPE袋進行真空包裝.

11)成熟：將制作的新鮮干酪在10 ℃條件下分別成熟0、30、60、90、120、150、180 d.

1.3.3 干酪感官品質的評定 感官評定方法參照GB 5420-2010的方法并改進.隨機抽取成熟第0、30、60、90、120、150、180 d干酪樣品，在25 ℃下放置1 h后.組成經過培訓篩選的10人評定小組，采用100分制，從色澤(20%)、組織狀態(tài)(30%)、滋味和氣味(50%)進行質量感官評定.具體評價標準見表1.

表1 牦牛乳硬質干酪質量評定標準

1.3.4 干酪苦味值的測定 參照Emmons等[12]的方法測定.評定小組由經培訓篩選的18人組成(男女比例為1∶1，均為不吸煙者)，評定員用蒸餾水漱口后，取適量干酪樣品置于口中5～10 s后吐出.用不同濃度的硫酸奎寧(0，2.9×10-3，5.8×10-3，1.2×10-2和 2.4×10-2mmol/L)作為參照物.0分表示完全無苦味；0～1.0分表示非常輕微苦味(包括1分)；1.0～2.0分表示輕微苦味(包括2分)；2.0～3.0分表示中等苦味(包括3分)；3.0～4.0分表示強苦味(包括4分)；4.0～5.0分表示非常強苦味(包括5分).

1.3.5 干酪質構品質的測定 參照孫彩玲等[13]的方法測定.樣品制備：測試樣品的尺寸為10 mm×10 mm×10 mm，在室溫(25±2)℃下平衡1 h后進行質構測試.質構參數(shù)：探頭類型為P/50，測試前速率為5.0 mm/s，測試中速率為1.0 mm/s，測試后速率為5.0 mm/s，下壓變形為50%，觸發(fā)力為0.2 N.

1.3.6 干酪出品率測定 參照任娟[14]的方法，將牦牛乳干酪壓榨完后稱質量，根據(jù)干酪原料乳質量與干酪質量計算干酪出品率.

為了更加準確地比較2種牦牛乳硬質干酪的出品率，將干酪的實測出品率校正到水分含量為45%時再進行計算.

1.3.7 干酪水分含量的測定 根據(jù)GB 5009.3-2010中直接干燥法進行水分含量測定.

1.3.8 干酪苦味肽的分離純化

1.3.8.1 干酪苦味肽的提取 參照Konstantinia等[15]的方法.將成熟120 d的酶凝和酸凝牦牛乳硬質干酪真空凍干，分別取50 g干酪切成碎片，加入150 mL蒸餾水用小型均質機高速攪拌2～15 s，然后通過Whatman.No 1濾紙抽真空過濾，在4 ℃下放置30 min除去脂肪.將沉淀物用100 mL和50 mL的蒸餾水兩次抽提.然后在水層中加入無水乙醇，調整其最終濃度達到60%，除去蛋白質.在4 ℃下低速攪拌1 h，在10 000 r/min離心30 min，除去不溶物.取上清液旋轉蒸發(fā)除去水和乙醇，濃縮液真空冷凍干燥備用.

1.3.8.2 干酪苦味肽的分離純化 將提取的干酪苦味肽配制成20 mg/mL，采用Sephadex G-25凝膠滲透層析分離純化.分離條件為凝膠柱1.6 cm×70 cm；上樣量1 mL；洗脫液為蒸餾水；流速為0.5 mL/min；紫外檢測儀在波長280 nm處進行檢測，以保留時間為橫坐標，洗脫液吸光值為縱坐標繪制洗脫曲線.收集組分峰，冷凍干燥備用.

1.3.8.3 干酪苦味肽分子量分布的測定 將分子量已知的標準品：氧化性谷胱甘肽(600 u)、氰鈷胺VB12(1 302 u)、抑肽酶(6 512 u)、細胞色素C(12 500 u)、卵清蛋白(43 000 u)分別溶于Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0)中，將上述真空凍干蛋白質配制成濃度為2 mg/mL的標準品溶液.將4種標準品溶液混合均勻，抽取混合樣品溶液1 mL上樣，紫外檢測儀在波長280 nm處進行檢測.以標準品分子量的對數(shù)為縱坐標，保留時間為橫坐標繪制標準曲線，標準曲線見圖1.

圖1 分子量標準曲線Figure 1 Standard curve of molecular weight

將干酪苦味肽進行層析分離，確定出峰時間，通過分子量標準曲線，將樣品峰的保留時間代入回歸方程y=-0.010 9x+4.652 7，計算干酪苦味肽分子量分布.用峰面積歸一化法，確定不同分子量范圍苦味肽的相對百分含量.

1.3.8.4 干酪不同分子量苦味肽苦味值測定 測定方法同1.3.4.

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗每個處理重復3次，采用Orign8.0軟件分析數(shù)據(jù)并作圖.

2 結果與分析

2.1 酸凝和酶凝干酪感官評分

由圖2可知，在整個成熟過程中，酶凝與酸凝干酪的感官評分均呈先升高后降低的趨勢，并且在90 d時感官品質都達到最佳.酶凝干酪風味濃郁，組織狀態(tài)好，苦味重；酸凝干酪由于沒有添加凝乳酶，其蛋白質降解程度小，色澤均勻，呈乳白色，滋氣味清淡，有適宜的乳香味和乳酸味，但其組織狀態(tài)松散，凝塊無彈性易碎，因此其總體感官評分較低.

圖2 酶凝與酸凝干酪感官評定Figure 2 Sensory evaluation of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

2.2 酸凝和酶凝干酪苦味值差異

從圖3可以看出，隨著成熟時間的延長，酶凝與酸凝干酪的苦味值呈先升高后下降的趨勢，并且都在120 d時苦味達到最大值，分別達到3.1(強苦味)和1.9(輕微苦味).成熟期0 d時，兩種干酪的苦味值均為0；在成熟30 d時，酸凝干酪苦味值仍為0；隨著成熟時間的增加，在30～180 d內，酶凝干酪的苦味值始終高于酸凝干酪，說明凝乳酶對干酪苦味形成的影響很大.

圖3 酶凝與酸凝干酪苦味值評價Figure 3 Bitter value of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

2.3 酸凝和酶凝干酪質構品質的差異

2.3.1 硬度 硬度反映干酪對變形抵抗的程度.由圖4可知，隨著成熟時間的延長，酶凝和酸凝干酪的硬度呈先增大后減小的趨勢，在成熟90 d時均達到最大值，分別為13.01 N和6.28 N.在整個成熟期，酸凝干酪的硬度始終小于酶凝干酪，主要是因為酸凝干酪在凝結時本身水分含量較高，干酪蛋白質分子中包含較多的結合水所致.90 d后干酪硬度發(fā)生下降，主要是因為成熟中期酶凝干酪蛋白質降解程度較大，使酪蛋白的凝膠網(wǎng)狀結構被破壞，干酪中的部分結合水進入干酪蛋白分子中，從而使干酪的硬度逐漸減小.

2.3.2 彈性 由圖5可知，隨著成熟時間的延長，酶凝和酸凝干酪的彈性呈先增大后減小的趨勢，在成熟90 d時均達到最大值，分別為0.78和0.47.在整個成熟期，酶凝干酪的彈性值始終大于酸凝干酪.這主要是由于適宜的水解可使干酪高度交聯(lián)的酪蛋白微膠束表現(xiàn)出較高的抗變形能力，體現(xiàn)出較高的彈性.隨著干酪的進一步水解，干酪長鏈結構蛋白不斷變短，直至酪蛋白網(wǎng)狀結構坍陷交融，干酪的彈性減小[16].

2.3.3 黏著性 黏著性反映了咀嚼時干酪對上腭、牙齒、舌頭等接觸面的黏性大小.干酪黏著性值的負號代表測試探頭受到的作用力方向向下，與大小無關.由圖6可知，在整個成熟期，兩種干酪的黏著性呈無規(guī)律的變化趨勢，在成熟中后期(即90 d以后)兩種干酪的黏著性下降，適口性較好.

圖5 酶凝與酸凝干酪的彈性Figure 5 Elasticity of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

圖6 酶凝與酸凝干酪的黏著性Figure 6 Adhesiveness of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

2.4 酸凝和酶凝干酪理化性質的差異

2.4.1 出品率 將干酪水分調整到45%，采用校正出品率進行比較，可忽略干酪中水分含量的影響.從表2可知，酶凝干酪校正出品率為22.87%，酸凝干酪校正出品率為19.44%.

2.4.2 水分含量 水分不僅影響干酪出品率，對干酪品質也有顯著影響.由圖7可知，酶凝和酸凝干酪水分含量在整個成熟期均呈逐漸下降的趨勢，由于干酪采用真空包裝，因此其水分含量降低程度很小，分別下降了0.73%、1.01%.在成熟0 d時，酶凝干酪水分含量為41.44%，酸凝干酪的水分含量為46.12%，高于酶凝干酪.說明凝乳酶在干酪生產過程中可促進乳清的排出，而在成熟過程中，雖然酸凝

表2 酶凝與酸凝干酪的出品率

圖7 酶凝與酸凝干酪的水分含量Figure 7 Moisture content of rennet-coagulated and acid-coagulated cheese

干酪有較低的蛋白水解能力，但其較差的網(wǎng)狀結構導致較多的水分析出.

2.5 酸凝和酶凝干酪苦味肽分子量的分布

2.5.1 酶凝干酪苦味肽的分離 由圖8可知，成熟120 d的酶凝干酪中提取的苦味肽經Sephadex G-25凝膠層析分離，得到4個大的組分峰，分別編號為A1，A2，A3，A4.由圖8可看出，在選定條件下層析分離時干酪苦味肽出峰較多且峰距適中，提取肽的分離效果較好.將4種組分的出峰保留時間代入標準曲線回歸方程，測得相應分子量，并分別收集各組分峰，測定酶凝干酪不同分子量苦味肽的苦味值.

圖8 酶凝干酪苦味肽葡聚糖凝膠層析譜圖Figure 8 Glucan gel chromatography spectrum diagram of rennt-coagulated cheese bitter peptide

2.5.2 酶凝干酪苦味肽分子量分布及苦味的測定 由表3可知，酶凝干酪成熟120 d時，其苦味肽分子量分布大約在428～3 908 u，其中2 466～3 908 u、1 386～2 249 u和663～1 352 u這3段苦味肽分子量范圍占到了總量的79.24%，并且表現(xiàn)出較強烈的苦味值，是酶凝干酪成熟120 d時苦味形成的重要貢獻者.低分子量肽段(428～648 u)由于苦味肽疏水性片段的進一步降解，生成較多的游離氨基酸，因此其苦味值相對其他3種組分低.

表3 酶凝干酪苦味肽分子量分布及苦味值

2.5.3 酸凝干酪苦味肽的分離 由圖9可知，成熟120 d的酸凝干酪中提取的苦味肽經Sephadex G-25凝膠層析分離，得到4個大的組分峰，分別編號為C1，C2，C3，C4.由圖9看出，在選定條件下提取肽的分離效果較好.將4種組分的出峰保留時間代入標準曲線回歸方程，測得相應分子量，并分別收集各組分峰，測定酸凝干酪不同分子量苦味肽的苦味值.

圖9 酸凝干酪苦味肽葡聚糖凝膠層析譜圖Figure 9 Glucan gel chromatography spectrum diagram of acid-coagulated cheese bitter peptide

2.5.4 酸凝干酪苦味肽分子量分布及苦味值的測定 由表4可知，酸凝干酪成熟120 d時，其苦味肽分子量分布大約在1 127～9 375 u，其中4 487～5 395 u、2 249～3 564 u這兩段苦味肽分子量范圍占到了總量的65.44%.分子量2 249～3 564 u的苦味肽表現(xiàn)出一定的苦味值，是成熟120 d酸凝干酪苦味形成的重要貢獻者.由于酸凝干酪中沒有添加凝乳酶，使其蛋白質降解程度和苦味值均小于酶凝干酪.

表4 酸凝干酪苦味肽分子量分布及苦味值

3 討論

本試驗結果表明，酸凝干酪產率低，水分含量高，滋氣味較好，苦味值低于酶凝干酪，組織狀態(tài)，硬度、彈性較差.凝乳酶是凝乳過程中的關鍵酶，其主要作用是促進牛乳的凝結，便于乳清析出，對干酪成熟過程中良好的質地與口感形成有重要影響.然而，酶凝干酪在成熟過程中殘留的凝乳酶對蛋白質的降解依然難以控制，易降解過度，導致干酪產生苦味物質、過于濃郁的風味或其他不良風味.因此，干酪加工生產過程中，凝乳酶添加量過高，會使干酪產生苦味，影響干酪風味及質地，這與García等[17]研究發(fā)現(xiàn)相似.

牦牛乳中干物質含量高，凝乳性能良好，出品率可達到20%左右[18].發(fā)酵劑中乳酸菌會利用原料乳中乳糖產生大量乳酸，為凝乳酶創(chuàng)造較好的凝乳條件，有利于凝塊的收縮并加速乳清排出，因此干酪水分含量低，出品率高[19].只用乳酸對原料乳進行凝固不易形成干酪優(yōu)良的蛋白質網(wǎng)狀結構，致使形成的凝塊也比較松散無彈性，用小刀切割過程中易破裂，排出乳清時易損失，因此酸凝干酪產率較低[20].試驗中干酪采用真空包裝，成熟過程中干酪水分含量呈現(xiàn)略微降低的趨勢，這與高婉偉等[21]的研究結果一致.Topcu等[22]曾發(fā)現(xiàn)Kasar干酪中苦味肽分子量在500～4 000 u和200～700 u.本試驗中酶凝與酸凝牦牛乳硬質干酪產生的苦味主要是500～5 000 u的疏水性多肽所引起的，這與Lee等[23]關于苦味肽的分子量分布研究結果基本一致.酶凝干酪苦味肽分子量小于酸凝干酪苦味肽分子量，說明凝乳酶對苦味肽的降解程度較大.

4 結論

1) 酸凝牦牛乳硬質干酪組織狀態(tài)松散，質構欠佳，但色澤均勻，滋氣味清淡，苦味值低.

2) 酶凝牦牛乳硬質干酪校正出品率高，水分含量較低，質構品質較好，說明凝乳酶的添加有利于凝塊的收縮并加速乳清排出，干酪產率較高.

3) 干酪成熟120 d時，酶凝牦牛乳硬質干酪中酪蛋白的降解更加充分，且降解產生的苦味肽苦味值較強烈；酸凝牦牛乳硬質干酪中苦味肽分子量較大，且苦味肽的苦味值較低.