劉希旻， 任 健， 童應(yīng)凱*， 陳添傲， 平煒杰， 付同帥， 顧逸飛

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)系，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384）

花椒籽富含蛋白質(zhì)和粗脂質(zhì)，并且資源豐富，是較好的脂肪源及蛋白源，然而花椒籽含有花椒酰胺類(lèi)（麻味）物質(zhì)和揮發(fā)油（香味）物質(zhì)，會(huì)影響飼料的適口性?；ń孵０冯m然有抗炎抑菌的功能，但動(dòng)物如果長(zhǎng)期攝入會(huì)對(duì)胃部及腸道造成損傷（葉敏，2015）?；ń孵０奉?lèi)物質(zhì)中包括羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素等。其中以羥基-α-山椒素的含量為酰胺類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，主要采用紫外分光光度法檢測(cè)花椒酰胺的含量。本文通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、白地霉（Geotrichum candidum）、布拉迪酵母（Saccharomyces cerevisiae boulardii）及溫莎啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的培育和篩選，旨在確定降解花椒酰胺類(lèi)物質(zhì)的菌種，并通過(guò)正交試驗(yàn)，尋找菌種的最佳生長(zhǎng)條件及最佳生長(zhǎng)元素添加量。以最大化地利用農(nóng)后廢物花椒籽，為養(yǎng)殖業(yè)提供一種植物蛋白和脂肪源的新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 花椒籽粉、麩皮，市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)；鮮花椒油，購(gòu)自成都陳麻婆；石油醚、甲醛（分析純），甲醇（優(yōu)級(jí)純），甲醇、正己烷（色譜純），購(gòu)自天津大茂；葡萄糖（分析純），購(gòu)自天津北方天醫(yī)；酵母浸膏（生化試劑，天津英博）；蛋白胨（生化試劑，湖北安琪）；酵母浸粉LP0021（生化試劑，英國(guó)OXOID）；硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、氫氧化鈉（均為分析純，天津風(fēng)船）；產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、布拉迪酵母、溫莎啤酒酵母，均為天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)系實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 儀器與設(shè)備 粉碎機(jī) （浙江榮浩）；分析天平（北京賽多利斯）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A （上海亞榮）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用）；低速離心機(jī)L550（湖南湘儀）；恒溫水浴鍋HH-4（金壇市瑞華）；KH5200DB型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津歐諾）；飛利浦紫外線(xiàn)燈（上海賴(lài)氏）；生物潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰）；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海求精）；生化培養(yǎng)箱SHP-250B（江蘇宏凱）。

1.3 培養(yǎng)基 YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%、酵母浸膏 1%、蛋白胨 2%，pH 6.0，121℃滅菌 20 min。

沙氏培養(yǎng)基：葡萄糖4%、蛋白胨1%，pH自然，121℃滅菌20 min。

中性紅油脂培養(yǎng)基：花椒油10%、酵母浸粉1%、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸亞鐵0.01%、0.1%中性紅指示液0.3 mL，pH 7.2～7.5，121℃滅菌20 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：花椒籽粉9 g、麩皮1 g、蒸餾水10 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 花椒籽中油脂含量的測(cè)定 國(guó)標(biāo)規(guī)定飼料粗脂肪含量為10%以上（含10%）。本試驗(yàn)采用抽提法測(cè)定花椒籽中油脂含量（馬榮萱等，2006）。稱(chēng)取8 g花椒籽粉，濾紙包好置于索氏提取器中，加入80 mL石油醚，置90℃水浴，回流虹吸15次停止加熱，待冷卻后，減壓蒸餾，直至無(wú)提取劑氣味，即為花椒籽油脂（表1）。

表1 花椒籽中油脂含量測(cè)定表

1.4.2 油脂降解菌的篩選 飼料中脂肪過(guò)多，會(huì)引起動(dòng)物消化不良、腹瀉，且不利于存儲(chǔ)，因此需進(jìn)行油脂降解菌的篩選。將產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、布拉迪酵母、溫莎啤酒酵母接種于中性紅油脂培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察。

1.4.3 花椒酰胺類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的制備 羥基-α-山椒素制備參照劉福權(quán)等（2017）的方法?；ń酚团c甲醇按體積比1:20，于40℃，160 r/min振蕩1 h后，超聲5 min。4000 r/min離心15 min，取上清液加入正己烷，體積比為1:2，萃取3次除去香味物質(zhì)。將下層液過(guò)堿性三氧化二鋁層析柱，所得液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行減壓蒸干，得到粗提取物。將粗提取物溶于10 mL色譜純甲醇，于紫外燈下15 cm處照射4 h，再進(jìn)行減壓蒸干。經(jīng)甲醛滴定法平行檢驗(yàn) （江燕竹，2016），獲得純度為98.21%的羥基-α-山椒素標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4.4 花椒酰胺類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定 將制取的羥基-α-山椒素標(biāo)準(zhǔn)品溶于一定量的甲醇中，再配制成不同濃度的溶液，在254 nm下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1）。

圖1 羥基-α-山椒素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.4.5 花椒酰胺類(lèi)降解菌的篩選 將產(chǎn)朊假絲酵母、布拉迪酵母、溫莎啤酒酵母接種于50 mL YEPD培養(yǎng)基中，白地霉接種于50 mL沙氏培養(yǎng)基中，于搖床中30℃，150 r/min培養(yǎng)24 h后，移取1 mL種子液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中。置于生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵產(chǎn)物各精確稱(chēng)取1.00 g移入10 mL離心管中，加入5 mL甲醇，在40℃下浸提4 h，其間不斷搖動(dòng)，離心后取上清液稀釋?zhuān)?54 nm處測(cè)定其吸光度值（付陳梅等，2003）（表 2）。

表2 不同菌種降解花椒酰胺類(lèi)物質(zhì)殘留量比m較g/g

1.4.6 微量元素正交試驗(yàn) 對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉，單一菌種及混合菌種進(jìn)行L9（34）的固體發(fā)酵生長(zhǎng)元素添加條件試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 微量元素添加條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表%

1.4.7 生長(zhǎng)條件正交試驗(yàn) 對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行L9（34）的生長(zhǎng)條件試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表 4。

表4 產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵生長(zhǎng)條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

微量元素正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表5和表6。由R值可知，影響產(chǎn)朊假絲酵母降解的微量元素添加條件依次為葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂；影響白地霉降解的微量元素添加條件依次為硫酸銨、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀。

表5 產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉單一菌種發(fā)酵微量元素添加條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉單一菌種發(fā)酵微量元素添加條件顯著性比較（LSD法）

由R值可知，影響產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵降解的微量元素添加條件依次為硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖（表7、表8）。

由R值可知，影響產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵降解的生長(zhǎng)條件依次為接種量、時(shí)間、料液比、溫度（表 9、表 10）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，固體發(fā)酵降解花椒酰胺類(lèi)物質(zhì)的最優(yōu)混合菌種為產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉。對(duì)比單一菌種發(fā)酵，混合菌種降解花椒酰胺類(lèi)物質(zhì)時(shí)間短，降解能力高，并大大降低了花椒籽粉中的揮發(fā)油類(lèi)（香味）物質(zhì)。經(jīng)正交試驗(yàn)確定混合菌種的最佳降解生長(zhǎng)條件為：溫度28℃，料液比1:1，接種量10%，時(shí)間24 h。生長(zhǎng)元素添加最佳條件為：（NH4）2SO40%，KH2PO40.2%，Mg-SO40.01%，葡萄糖0.5%。經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，花椒酰胺類(lèi)物質(zhì)平均殘留量為3.5776 mg/g。且發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)感官性評(píng)價(jià)無(wú)花椒揮發(fā)油氣味，麻味明顯下降，油脂含量適中。

表7 產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵微量元素添加條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表9 產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵生長(zhǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵微量元素添加條件顯表著性比較（LSD法）

10 產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵生長(zhǎng)條件顯著性比較（LSD法）