王杰 于廣鑫 魯鳳民

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球約20 億人感染過(guò)HBV，其中2.57 億人為慢性HBV感染者，每年約有65 萬(wàn)人死于HBV 感染所致的肝硬化和肝細(xì)胞癌（Hepatic cell carcinoma，HCC）等終末期肝?。?-2］。2016年，我國(guó)人群乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）流行率估計(jì)為6.1%，慢性HBV 感染者約8 600 萬(wàn)人，接近全球慢性HBV 感染的1/3。在這些慢性HBV 感染者中，約有2 000 多萬(wàn)例為慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者，約100 萬(wàn)例為肝硬化患者，30 萬(wàn)例為HCC 患者［3］。目前，臨床上主要通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)和HBV核酸（DNA）檢測(cè)進(jìn)行HBV 感染的診斷和抗病毒療效的監(jiān)測(cè)［4］。在我國(guó)，提出高靈敏度HBV-DNA檢測(cè)試劑這一表述有其特殊性，主要是針對(duì)我國(guó)早期的HBV DNA 定量檢測(cè)試劑靈敏度相對(duì)較低而言。相比于國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)的HBV DNA 檢測(cè)試劑，高靈敏度HBV DNA檢測(cè)試劑具有更低的檢測(cè)下限和更廣的線性范圍，且特異性好，能夠縮短檢測(cè)的窗口期，更高效地實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV 感染的早期診斷，進(jìn)而更好地實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)治療和阻斷HBV 傳播的目的。因此，高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)在OBI（Occult hepatitis B virus infection，OBI）篩查、術(shù)前檢查、腫瘤患者放、化療后HBV再激活風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、抗病毒治療療效與終點(diǎn)評(píng)價(jià)以及預(yù)測(cè)HBV 表面抗原（HBeAg）陰性患者HBV 耐藥突變等方面表現(xiàn)出了突出的臨床價(jià)值。

1 高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)與OBI 和術(shù)前HBV 篩查

1.1 OBI 與輸血安全

1978年科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)HBsAg 陰性、核心抗體（抗-HBc）陽(yáng)性的獻(xiàn)血者血液可使受血者感染HBV，并提出了OBI 可能會(huì)導(dǎo)致HBV 傳播的觀點(diǎn)［5］。最初，診斷OBI 主要依賴于HBV 的血清學(xué)抗原、抗體標(biāo)志物和HBV DNA 的檢測(cè)［6-8］。隨后，人們發(fā)現(xiàn)血清HBV DNA 的檢測(cè)不足以完全判定OBI，而肝組織中HBV DNA 的檢測(cè)可能是判定OBI 更可靠的方法［9-11］。2007年，Raimondo 等提出檢測(cè)肝組織或血清中HBV DNA 的不同區(qū)域可提高OBI 檢測(cè)的靈敏度和可靠性［12］。

2008年OBI 被首次定義為：排除HBV 感染窗口期，按照現(xiàn)有血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)血清HBsAg 陰性，無(wú)論血清中能否檢測(cè)到HBV DNA，但肝組織中HBV DNA 陽(yáng)性［13］。隨著基因擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RCR 和液滴數(shù)字PCR 先后被用于OBI 的實(shí)驗(yàn)室診斷，并通過(guò)對(duì)肝組織和血清HBV DNA 的多個(gè)區(qū)域進(jìn)行特異性檢測(cè)，以兩個(gè)及以上區(qū)域檢出陽(yáng)性作為診斷OBI 的標(biāo)準(zhǔn)［13］。眾所周知，由共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的HBV 前基因組RNA（pregenomic RNA，pgRNA）經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成病毒DNA 負(fù)鏈，再經(jīng)跳轉(zhuǎn)后合成正鏈，形成不完全閉合的松弛環(huán)狀雙鏈DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）［14］。由于3.5 kb 長(zhǎng)的pgRNA 只能來(lái)源于cccDNA，所以pgRNA 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的rcDNA 也只能來(lái)源于cccDNA，rcDNA 的存在不僅間接反映了cccDNA 的存在，更提示其處于轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)。此外，rcDNA 也是cccDNA 的唯一來(lái)源。因此，cccDNA 和/或rcDNA 的存在均具有HBV 再激活和再感染的潛能。與之不同的是，整合至宿主基因組的HBV DNA 片段主要來(lái)源于病毒正鏈DNA 合成時(shí)錯(cuò)誤跳轉(zhuǎn)所形成的雙鏈線性HBV DNA（double strands linear DNA，dslDNA），所以其不具有作為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生子代病毒的能力［15-16］。由于整合的HBV DNA 片段的斷端主要集中在HBV 基因組的直接重復(fù)區(qū)（direct repeat，DR）1 和DR2 附近，這一特性使我們能夠很好地將具有完整病毒復(fù)制潛能的cccDNA 和rcDNA 與整合的HBV DNA 片段區(qū)分開來(lái)。在排除了整合HBV DNA 的干擾之后，rcDNA 和/或cccDNA 檢出陽(yáng)性，即可被判定為OBI。在此基礎(chǔ)上，我們建議OBI 應(yīng)更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囟x為：排除HBV 感染的窗口期，按照現(xiàn)有血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)HBsAg 陰性，血清HBV DNA 低于檢測(cè)下限或低值陽(yáng)性（＜200 IU/mL），但肝組織中HBV rcDNA 和/或cccDNA 陽(yáng)性［17-18］。

OBI 發(fā)生的主要原因是由于肝組織內(nèi)cccDNA很難被清除，大部分HBV 被宿主免疫清除后仍有少量病毒殘留，導(dǎo)致HBV 低水平復(fù)制［19］。另外，免疫復(fù)合物的形成、S 基因變異以及合并其他肝炎病毒感染也是導(dǎo)致OBI 發(fā)生的原因［20］。OBI 的流行率與HBV 感染率呈正相關(guān)［21］。我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，HBV 既往感染人數(shù)曾占全人群的50%以上，獻(xiàn)血者中OBI 檢出率約為0.03%～0.2%，也明顯高于西方發(fā)達(dá)國(guó)家0.007%～0.05%的水平［22］。如何避免感染HBV 的供血者的血液造成輸血后感染，是輸血的各種風(fēng)險(xiǎn)中需要防范的重點(diǎn)之一。盡管隨著血清學(xué)檢測(cè)靈敏度的不斷提高，通過(guò)HBsAg 的篩查排除了絕大多數(shù)HBV 感染者，使得輸血造成HBV 感染的風(fēng)險(xiǎn)大大降低，但OBI 引起的輸血后HBV 感染仍不能被有效排除。HBV 核酸檢測(cè)（nucleic acid test，NAT）是避免輸血后HBV 感染的篩查手段之一，我國(guó)于2015年12月將NAT 納入血液常規(guī)檢測(cè)［23］。目前，NAT 的靈敏度已有較大提高，檢測(cè)下限已由之前的20 IU/mL 下降至3.4 IU/mL［24-25］。我國(guó)輸血后HBV 感染的風(fēng)險(xiǎn)隨著HBV DNA 檢測(cè)靈敏度的提高日益下降，但輸血后HBV 感染的問(wèn)題依然存在。根據(jù)Locarnini 等的計(jì)算，NAT 的檢測(cè)下限需要達(dá)到0.15 IU/mL 才能完全避免輸血后HBV 感染［26］。由此可見，HBV DNA 檢測(cè)的靈敏度仍需進(jìn)一步提高。

1.2 術(shù)前HBV 篩查

HBV 是一類具有很高醫(yī)源性感染風(fēng)險(xiǎn)的病毒，極少量含病毒的血液或血清就可導(dǎo)致該病毒的傳播［27］。臨床上進(jìn)行手術(shù)、侵入性操作、血液透析以及醫(yī)療器械未經(jīng)有效嚴(yán)格消毒等均會(huì)增加HBV 醫(yī)源性感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，針對(duì)手術(shù)患者進(jìn)行術(shù)前HBV 篩查是很有必要的。目前術(shù)前HBV 篩查手段主要有血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子診斷技術(shù)兩種，其中血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)志物主要包括HBsAg、表面抗體（抗-HBs）、HBeAg、e 抗體（抗-HBe）和抗-HBc，即乙肝五項(xiàng)；主要檢測(cè)方法有膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光法和重組免疫印跡試驗(yàn)等；分子診斷技術(shù)主要指HBV DNA 的定量檢測(cè)［28］。由于隱匿性感染、病毒感染后的窗口期以及部分患者存在病毒抗原突變等原因，使得血清學(xué)標(biāo)志物的檢查容易造成漏診［28］。高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)試劑的最低檢測(cè)限可達(dá)10～15 IU/mL，在檢測(cè)靈敏度和特異性方面有較大優(yōu)勢(shì)，可更準(zhǔn)確地診斷HBV 感染，并能夠顯著縮短檢測(cè)的窗口期，故可更有效地規(guī)避HBV 醫(yī)源性感染的風(fēng)險(xiǎn)［29］。

2 高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)對(duì)腫瘤患者放、化療后HBV 再激活的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

惡性腫瘤導(dǎo)致人口死亡約占全球總死亡人數(shù)的六分之一。2015年惡性腫瘤導(dǎo)致全球880萬(wàn)人死亡，預(yù)計(jì)新病例數(shù)量將在未來(lái)20年內(nèi)增加約70%［30］。除手術(shù)和放療外，化療仍是最常見的治療惡性腫瘤的方法。我國(guó)的乙肝疫苗接種始于1992年，現(xiàn)階段既往HBV 感染單核心抗體陽(yáng)性者（單抗-HBc 陽(yáng)性）在我國(guó)中老年人群中仍占有較大的比例。隨著預(yù)期壽命的不斷延長(zhǎng)和全球惡性腫瘤新病例的不斷增加，化療引起的HBV 再激活將是一個(gè)更加嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

HBV DNA 從一定的水平或檢測(cè)不到發(fā)展至顯著增加的狀態(tài)，即高于基線水平2 log 或新出現(xiàn)的HBV DNA 水平達(dá)到100 IU/mL 以上，被定義為HBV 再激活［31］。HBV 再激活的主要因素是宿主失去對(duì)HBV 復(fù)制的免疫控制。在化療期間，當(dāng)免疫系統(tǒng)被抑制時(shí)，HBV 復(fù)制顯著增加，并引起肝細(xì)胞的廣泛感染。化療停止后，免疫功能恢復(fù)，感染HBV的肝細(xì)胞可觸發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致較為嚴(yán)重的肝損傷［32］。

預(yù)防HBV 再激活的重要措施是對(duì)高危人群進(jìn)行早期識(shí)別，在病毒激活之前加以預(yù)防。研究表明，每月監(jiān)測(cè)血清HBV DNA 的水平（最低檢測(cè)下限為11 IU/mL）能夠有效地預(yù)防既往感染過(guò)HBV 的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者發(fā)生HBV 再激活［33］。美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)在2015年的“暫行臨床意見”中指出，對(duì)于HBsAg 陰性/抗-HBc 陽(yáng)性人群，應(yīng)定期監(jiān)測(cè)其血清HBV DNA 和ALT 水平，若發(fā)生HBV 再激活，應(yīng)立即進(jìn)行抗病毒治療［34］。同樣，我國(guó)的慢乙肝防治指南中也要求對(duì)于所有因其他疾病而接受放療、化療、免疫抑制劑治療的患者，在治療前都應(yīng)常規(guī)篩查HBsAg、抗-HBc 和HBV DNA［2］。這說(shuō)明，無(wú)論是HBV 再激活高危人群的早期篩查還是腫瘤患者放化療后監(jiān)測(cè)HBV 再激活的風(fēng)險(xiǎn)，高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)均具有重要的臨床意義。

3 高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)評(píng)價(jià)抗病毒治療的療效與終點(diǎn)

目前，各國(guó)（地區(qū)）的慢乙肝防治指南根據(jù)高靈敏度檢測(cè)試劑的檢測(cè)能力對(duì)HBV DNA 檢測(cè)下限進(jìn)行了設(shè)定，并以此指導(dǎo)抗病毒療效的評(píng)價(jià)以及抗病毒治療終點(diǎn)建議的評(píng)估。亞太肝病研究學(xué)會(huì)（Asia Pacific association for the study of liver，APASL）2015年版慢乙肝防治指南中將HBV DNA＜12 IU/mL 設(shè)定為低于檢測(cè)下限［35］；美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)（American Association for the study of liver disease，AASLD）2018年版慢乙肝防治指南中則分別對(duì)恩替卡韋、替諾福韋和替諾福韋艾拉酚胺（二代替諾福韋）完全病毒學(xué)應(yīng)答時(shí)的HBV 檢測(cè)下限進(jìn)行了設(shè)定，分別為60 IU/mL、60 IU/mL 和29 IU/mL［36］；歐洲肝臟研究協(xié)會(huì)（European Association for the Study of the Liver，EASL）2017年版慢乙肝防治指南中將HBV DNA＜10 IU/mL 設(shè)定為抗病毒治療的完全病毒學(xué)應(yīng)答［37］；世界衛(wèi)生組織（WHO）2015年版慢乙肝防治指南中則將檢測(cè)下限設(shè)定為15 IU/mL［38］；我國(guó)2015年版慢乙肝防治指南中雖然沒(méi)有明確給出HBV DNA 的檢測(cè)下限，但仍規(guī)定非活動(dòng)性HBV 攜帶者必須滿足HBV DNA低于檢測(cè)下限或＜200 IU/mL2。這說(shuō)明，相對(duì)于國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)的檢測(cè)下限較高的HBV DNA 定量檢測(cè)試劑而言，高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)可更好地評(píng)價(jià)慢乙肝抗病毒療效以及評(píng)估抗病毒治療的終點(diǎn)。

4 高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)預(yù)測(cè)HBeAg 陰性患者HBV 耐藥突變

HBeAg 是反映HBV 復(fù)制和感染能力的一個(gè)重要指標(biāo)，臨床上常用HBV 復(fù)制抑制、ALT 水平恢復(fù)正常、HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換來(lái)評(píng)估慢乙肝患者抗病毒治療的效果。但值得注意的是，HBeAg 陰性并不能完全代表HBV 處于復(fù)制抑制狀態(tài)。雖然HBeAg 陰性慢乙肝患者中HBV 載量較低，但HBeAg 轉(zhuǎn)陰可能是由于HBV 基因變異引起的，此時(shí)的病毒仍處于活躍復(fù)制狀態(tài)，并更容易對(duì)抗病毒藥物產(chǎn)生耐藥［39］。此外，對(duì)于此部分HBV 耐藥突變患者，傳統(tǒng)的靈敏度較低的HBV DNA 檢測(cè)無(wú)法為血清HBV DNA 是否真正轉(zhuǎn)陰提供可靠參考。研究表明，對(duì)于HBeAg 陰性慢乙肝患者進(jìn)行高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)，可更好地觀察抗病毒療效和優(yōu)化抗病毒治療方案［40］。由此可見，高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)能夠更加有效地判斷HBeAg 陰性患者的抗病毒療效，并為HBV 耐藥突變的預(yù)測(cè)及治療方案的調(diào)整提供可靠參考。

5 總結(jié)

高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)以其檢測(cè)下限低和線性范圍廣等優(yōu)勢(shì)，已逐步應(yīng)用于慢乙肝的臨床診斷和抗病毒療效評(píng)價(jià)的各個(gè)環(huán)節(jié)中，并且更符合“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、精準(zhǔn)治療”的要求。然而，高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)仍存在一些亟需解決的問(wèn)題。首先，高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)的靈敏度仍有待進(jìn)一步提高，如輸血篩查理論上需要檢測(cè)試劑的最低檢測(cè)下限達(dá)到0.15 IU/mL 才能完全避免HBV 感染，這是現(xiàn)階段難以企及的高度。其次，極高的檢測(cè)靈敏度意味著檢測(cè)結(jié)果更容易受核酸污染的影響，這要求更加嚴(yán)格的操作環(huán)境和更加規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。此外，現(xiàn)階段高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化管理尚不健全，這導(dǎo)致不同廠家、不同機(jī)構(gòu)所生產(chǎn)和使用的儀器和試劑所表達(dá)的“高靈敏度”參差不齊，檢驗(yàn)效能上存在較大差異。雖然現(xiàn)階段高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)面臨這些問(wèn)題，但其在OBI 篩查、術(shù)前HBV 篩查、腫瘤患者放、化療前HBV 篩查、評(píng)價(jià)慢乙肝患者抗病毒治療的療效與終點(diǎn)、以及預(yù)測(cè)HBeAg 陰性慢乙肝患者發(fā)生HBV耐藥突變風(fēng)險(xiǎn)等方面具有難以替代的優(yōu)勢(shì)。相信未來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及相關(guān)機(jī)構(gòu)的逐步重視，高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)會(huì)更加快速地發(fā)展，并在臨床上得到更加廣泛的應(yīng)用。