靳英麗,屈智慧,楊盼盼,袁渤雨,陳麗波

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021； 2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

糖尿病腎病(DN)為糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是引起終末期腎病的重要原因。DN的特征性標(biāo)志是蛋白尿，足細(xì)胞參與構(gòu)成腎小球的濾過屏障，其損傷導(dǎo)致早期DN蛋白尿的發(fā)生，是DN發(fā)病與進(jìn)展的中心靶點(diǎn)[1]。Nephrin、podocin是構(gòu)成足細(xì)胞裂孔隔膜的關(guān)鍵蛋白，其中nephrin特異性地在腎小球足細(xì)胞中表達(dá)?；蛲蛔兓蚋咛堑葢?yīng)激條件造成的nephrin表達(dá)減少可導(dǎo)致裂孔隔膜破壞和蛋白尿，因此，nephrin可作為腎小球足細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志[2]。Podocin是一種支架蛋白，對維持足細(xì)胞裂孔隔膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性起重要作用。Podocin突變或表達(dá)減少，可出現(xiàn)早期蛋白尿、足突融合、裂孔隔膜消失等腎臟損害[3]。

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，化學(xué)名為3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮，具有多種生物學(xué)活性及很高的藥用價(jià)值。槲皮素廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中。槲皮素藥理作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、免疫調(diào)節(jié)及心血管保護(hù)作用等[4-6]，對糖尿病并發(fā)癥如心血管疾病、視網(wǎng)膜病變、DN等有很好療效[7-9]，愈加受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注和重視。近年來有關(guān)槲皮素抗DN的作用機(jī)制研究主要集中在對系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的作用上。故本實(shí)驗(yàn)以糖尿病大鼠為研究對象，研究槲皮素對糖尿病大鼠腎臟功能及腎皮質(zhì)足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin及podocin表達(dá)的影響，探討槲皮素的抗DN作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料動物選取SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200-250 g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號：SYXK(吉)2007-0011)。試劑：鏈脲佐菌素(STZ)規(guī)格：100 mg /支(美國Sigma-Aldrich公司)，槲皮素(10 g/支，美國Sigma-Aldrich公司)，anti-nephrin、anti-podocin、anti-β-actin、 IgG二抗(美國Abcam公司)。主要儀器：微量血糖測定儀(Free Style，美國雅培公司)，全自動生化分析儀(美國Beckman公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，電泳儀及蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物分組及模型制備雄性Wistar大鼠禁食不禁水12 h，單次腹腔注射STZ 55 mg/kg(溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH 4.2)。注射STZ 后72 h尾尖采血，微量血糖測定儀檢測隨機(jī)血糖，以血糖濃度≥16.7 mmol/L確定為糖尿病模型制備成功，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)大鼠棄去不用。造模成功的大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(Diabetic model，DM，n=8)，槲皮素給藥組(Qu,n=8，劑量100 mg/kg/d)。槲皮素給藥方式為灌胃給藥，按上述劑量每日1次，共12周；正常對照組(CON，n=8)以等體積枸櫞酸緩沖液代替STZ及槲皮素給藥。

1.3標(biāo)本采集實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d，各組大鼠用代謝籠收集24 h尿液，留用測定24 h尿中總蛋白、白蛋白、尿素和肌酐水平。大鼠空腹8 h后稱重，乙醚麻醉后腹主動脈取血、分離血清，待測血肌酐、尿素水平。摘取腎臟，去除被膜后稱重。去除腎臟髓質(zhì)，皮質(zhì)放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃保存。

1.4腎臟指數(shù)的計(jì)算及血、尿生化指標(biāo)測定各組大鼠稱量體質(zhì)量和腎臟濕重，計(jì)算腎臟肥大指數(shù)(腎重/體質(zhì)量，KW/BW)。用全自動生化分析儀對采集的血液樣品進(jìn)行血肌酐、尿素的檢測，對采集的尿液樣品進(jìn)行尿總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素水平檢測。

1.5Westernblot方法檢測腎皮質(zhì)nephrin和podocin的蛋白表達(dá)稱取10 mg冰凍腎皮質(zhì)，在100 μl冰預(yù)冷的懸浮緩沖液中將組織剪碎，加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液，混合后置于沸水浴中加熱5 min，超聲處理儀剪切。10 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)行BCA法蛋白定量，取50 μg總蛋白的組織裂解產(chǎn)物進(jìn)行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后置于封閉液中，室溫封閉1-2 h，TBS漂洗膜3次，分別加anti-nephrin、anti-podocin、anti-β-actin進(jìn)行一抗孵育，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗，放入搖床室溫?fù)u動1 h，漂洗后ECL顯色，拍照。Western條帶用Quantity one軟件分析。結(jié)果以目的蛋白OD值與內(nèi)參β-actin的OD值比值表示。

2 結(jié)果

2.1槲皮素對糖尿病大鼠腎臟指數(shù)及血中肌酐、尿素水平的影響

糖尿病模型分組給藥 12周后，檢測大鼠腎臟指數(shù)、血肌酐及尿素，結(jié)果如表1所示，與正常對照組相比，糖尿病模型組腎臟指數(shù)、血肌酐和血尿素氮水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)，提示腎臟肥大、腎功能受損；槲皮素給藥12周后，槲皮素給藥組與糖尿病模型組相比，腎臟指數(shù)降低(P<0.05)、血肌酐和尿素明顯降低(P<0.01)。

表1 槲皮素對糖尿病大鼠腎臟指數(shù)及血肌酐、尿素水平的影響

注：與正常對照組比較*P<0.05，* *P<0.01；與糖尿病模型組比較#P<0.05，# #P<0.01。

2.2槲皮素對糖尿病大鼠24h尿中總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素水平的影響

分組給藥12周后，檢測大鼠24 h尿總蛋白、白蛋白、尿中肌酐、尿素含量，結(jié)果如表2所示。與正常對照組相比，糖尿病模型組24 h尿總蛋白、白蛋白明顯升高(P<0.01)；尿中肌酐和尿素水平明顯降低(P<0.01)；槲皮素給藥 12周后，槲皮素給藥組與糖尿病模型組相比，24 h尿中總蛋白和白蛋白水平都明顯降低(P<0.01)，尿中肌酐和尿素水平升高(P<0.05)。

表2 槲皮素對糖尿病大鼠尿中總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮水平的影響

注：與正常對照組比較*P<0.05，* *P<0.01；與糖尿病模型組比較#P<0.05，##P<0.01。

2.3槲皮素對糖尿病大鼠腎皮質(zhì)足細(xì)胞nephrin和podocin蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot方法檢測nephrin和podocin在各組大鼠腎皮質(zhì)中的蛋白表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示，糖尿病模型組足細(xì)胞標(biāo)志蛋白nephrin和podocin表達(dá)明顯比正常對照組下降，槲皮素治療組腎皮質(zhì)nephrin和podocin表達(dá)水平高于糖尿病模型組(圖1)。

注：CON：正常對照組，DM：糖尿病模型組，QU：槲皮素給藥組。 * *與正常對照組比較，P<0.01；#與糖尿病模型組比較，P<0.05。

3 討論

我國是全世界糖尿病發(fā)病的第一大國，約有1/3病例會發(fā)展為DN，是引起終末期腎病的重要原因。目前DN尚無特效治療藥物，故探索DN發(fā)病機(jī)制及尋找安全有效的抗DN新藥具有十分重要的意義。

已知100 多種中草藥中含有槲皮素，其廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中，如槐米、槐花、丹皮、菊花、田基黃、車前子等。槲皮素藥理作用非常廣泛，包括對DN的作用。本研究中，我們給予糖尿病大鼠槲皮素灌胃12周之后進(jìn)行腎臟指數(shù)及腎功能相關(guān)指標(biāo)的檢測。結(jié)果表明，槲皮素給藥組的24 h尿中總蛋白和白蛋白水平都較糖尿病模型組明顯降低(P<0.01)，尿中肌酐和尿素水平升高(P<0.05)。槲皮素給藥組的腎臟指數(shù)、血肌酐和尿素較糖尿病模型組降低。結(jié)果提示槲皮素改善了糖尿病大鼠的腎功能、減輕了蛋白尿。

糖尿病腎病的病理特點(diǎn)包括持續(xù)加重的蛋白尿、腎臟肥大、腎小球基底膜增厚、腎小球硬化等。蛋白尿在DN的進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵作用，足細(xì)胞附著在腎小球基底膜外側(cè)，足突之間的裂孔隔膜構(gòu)成腎小球?yàn)V過的最后一道屏障。足細(xì)胞損傷會導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生，進(jìn)而引起腎小球硬化纖維化并最終進(jìn)展為終末期腎病。在糖尿病腎病條件下，高血糖可直接損傷足細(xì)胞造成足細(xì)胞肥大、足突變寬融合、足細(xì)胞數(shù)目減少等病理現(xiàn)象[10]。槲皮素是如何發(fā)揮對糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用、減輕蛋白尿的呢？有關(guān)槲皮素抗DN作用機(jī)制的研究主要集中在藥物對系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的作用上。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)槲皮素通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路而抑制高糖下系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積聚[11]，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)槲皮素通過抑制mTORC1/p70S6K信號通路減輕糖尿病腎病的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)化和腎纖維化[12]。

在本研究中，我們研究了槲皮素對腎小球足細(xì)胞的影響，即對足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin和podocin表達(dá)的影響。結(jié)果表明，糖尿病大鼠腎臟組織中nephrin和podocin表達(dá)較正常對照組明顯降低。而槲皮素給藥后大鼠腎臟組織中nephrin和podocin表達(dá)較糖尿病模型組明顯升高。結(jié)果提示在糖尿病腎病時存在足細(xì)胞損傷，槲皮素可以在一定程度上增強(qiáng)裂孔膜蛋白nephrin和podocin表達(dá)。由此，我們判斷槲皮素可能通過增強(qiáng)nephrin和podocin的表達(dá)，從而改善DN時足細(xì)胞損傷，進(jìn)而減輕蛋白尿、發(fā)揮抗DN作用。