董丹丹，劉真真，李篤軍，張 會，趙 輝,賈 楠，朱元祺*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島266071;2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科;3.山東煙臺業(yè)達醫(yī)院 檢驗科)

碳青霉烯類抗生素是一類抗菌譜廣、抗菌活性強的β-內(nèi)酰胺類抗生素，對 Amp C酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定,是臨床抗感染的最后一道防線。但近幾年，碳青霉烯類耐藥的革蘭氏陰性菌在全球范圍內(nèi)逐年增多，給臨床治療帶來了挑戰(zhàn)[1，2]。弗氏檸檬酸桿菌是檸檬酸桿菌屬最常見的分離株，也是醫(yī)院感染中常見的革蘭氏陰性桿菌。因此，我們對2012年4月-2018年5月分離的12株耐碳青霉烯類弗氏檸檬酸桿菌的耐藥表型、耐藥基因和同源性進行研究，為醫(yī)院感染的預(yù)防和采取控制措施提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1實驗菌株資料12株耐碳青霉烯類的弗氏檸檬酸桿菌(CFR1-CFR12)于2012年4月-2018年5月分離自住院患者。病人年齡11-80歲，平均54歲。菌株鑒定和藥敏試驗為梅里埃Vitek-2 Compact系統(tǒng)。藥敏使用GN13卡，并依據(jù)CLSI-M100(2018)標準判定結(jié)果。blaKPC和blaNDM陽性對照菌株為本室保留。藥敏質(zhì)控菌株為ATCC35218、ATCC700603、ATCC25922和ATCC27853。

1.2儀器設(shè)備和試劑脈沖場凝膠電泳儀和PCR擴增儀為美國BIO-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng)為美國Alpha Innotech公司；核酸分子量標準和PCR試劑等為寶生物(大連)工程有限公司。

1.3耐藥基因檢測PCR檢測菌株產(chǎn)碳青霉烯酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶耐藥相關(guān)基因。PCR擴增耐藥基因的引物序列及方法參照文獻[3]。生工(上海)生物技術(shù)有限公司完成引物合成和擴增產(chǎn)物測序。

1.4脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳的方法、結(jié)果解釋參照文獻[3,4]。電泳條件：轉(zhuǎn)換角度120°，場強6V/cm，轉(zhuǎn)換時間1-20秒，電泳時間為19 小時。依據(jù)Dice系數(shù)和UPGMA聚類，使用BioNumerics(7.6)軟件對脈沖場凝膠電泳進行分析。

2 結(jié)果

2.1菌株的藥敏和攜帶的耐藥基因

除了CFR-6 和CFR-10這兩株菌僅對氨曲南敏感外，12株弗氏檸檬酸桿菌對其他β-內(nèi)酰胺類抗生素都耐藥，且多數(shù)菌株對氨基糖苷類、喹諾酮類和磺胺甲惡唑/甲氧芐啶抗菌藥物也表現(xiàn)出耐藥。PCR擴增和測序表明：12菌株中的每一株都攜帶多個耐藥基因，且分別攜帶blaKPC-2(4/12，33.3%)、blaNDM-1(6/12，50%)和blaIMP-4(2/12，16.7%)耐藥基因；除了碳青霉烯酶耐藥基因外，每一株還同時攜帶不同亞型的blaCMY基因。菌株信息、藥敏和耐藥基因檢測結(jié)果詳見表1-2和圖1-3。

2.2菌株的脈沖場凝膠電泳和聚類分析

脈沖場凝膠電泳聚類分析顯示12株弗氏檸檬酸桿菌之間有75.8%-89.6%的相似度，其中CFR11和CFR12分離株相似度89.6%，CFR2、CFR7和CFR10之間相似度85.0%-87.3% ，但依據(jù)病例資料、Tenover規(guī)則和流行病學(xué)“三間”分布特征，判定這12株弗氏檸檬酸桿菌之間不存在克隆聚集性，即為散發(fā)克隆。菌株相似度聚類分析詳見圖4。

3 討論

碳青霉烯酶是一類能水解碳青霉烯類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶。依據(jù)Ambler 分類，包括A、B和D三類。其中，A和D類為絲氨酸酶，B類為金屬酶(MBL)。產(chǎn)碳青霉烯酶是菌株對碳青霉烯酶類抗生素耐藥的主要原因。blaKPC-2是A類中最常見的類型。國內(nèi)ST11型和國外ST258型肺炎克雷伯菌是攜帶blaKPC-2基因最常見的醫(yī)院感染分離株[1，5，6]。B類金屬酶中以blaNDM和blaIMP為主。其中，前者代表菌是以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為主[5]，后者是第一個最早被發(fā)現(xiàn)的金屬酶(MBL，IMP-1)，主要見于銅綠假單胞菌。但近幾年，IMP在腸桿菌中檢出逐年增多。D類酶主要是blaOXA-48，我國目前報道較少[6]。

表1 12株弗氏檸檬酸桿菌對常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果

注：TZP(哌拉西林/他唑巴坦)，CAZ(頭孢他啶)，CRO(頭孢曲松)，F(xiàn)EP(頭孢吡肟)，ATM(氨曲南)，ETP(厄他培南)，IPM(亞胺培南),AK(阿米卡星)，CN(慶大霉素)，TOB(妥布霉素)，CIP(環(huán)丙沙星)，LEV(左氧氟沙星)，SXT(磺胺甲惡唑/甲氧芐啶)

表2 12株弗氏檸檬酸桿菌攜帶的耐藥基因

M：DNA分子量標準；Lane1-12：CFR-1-12菌株；N：陰性對照；P：blaKPC陽性對照

M：DNA分子量標準；Lane1-12：CFR-1-12菌株；N：陰性對照；P： blaNDM陽性對照

M：DNA分子量標準；Lane1-12：CFR-1-12菌株；Lane13：陰性對照

研究顯示，12株弗氏檸檬酸桿菌對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素呈現(xiàn)多重耐藥，并攜帶多個耐藥基因。其中，攜帶blaKPC-2、blaNDM-1和blaIMP-4分別為33.3%(4/12)，50%(6/12)和16.7%(2/12)。除了攜帶碳青霉烯酶耐藥基因外，每一株菌還攜帶屬于AmpC酶中的blaCMY基因，且呈現(xiàn)不同的亞型，如blaCMY-6、blaCMY-34、blaCMY-46、blaCMY-48，blaCMY-49和blaCMY-83。另外，攜帶blaKPC-2基因的弗氏檸檬酸桿菌分離株同時存在blaCTX-M-3和blaTEM-1基因，這三個基因是否存在于一個質(zhì)粒上，有待于進一步證實。

注：依據(jù)Dice系數(shù)和UPGMA聚類構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，基因組相似比例見左側(cè)樹狀圖。Key1-12：弗氏檸檬酸桿菌CFR1-CFR12菌株。

目前，國內(nèi)外已有報道在弗氏檸檬酸桿菌中檢測到菌株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因。Arana在西班牙2013-2015年分離的檸檬酸桿菌屬中檢測到多種碳青霉烯酶耐藥基因，包括VIM-1，OXA-48，KPC-2，NDM-1和VIM-2基因[7]。國內(nèi)Feng 報道[8]，分別攜帶KPC-2和NDM-1的質(zhì)粒共存于一株弗氏檸檬酸桿菌中，這增加了細菌耐藥的復(fù)雜性。在檸檬酸桿菌中，碳青霉烯酶耐藥基因blaIMP很少檢出，僅有Xiong于2016年報道一株攜帶blaIMP-4的弗氏檸檬酸桿菌[9]。

對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌檢出增多與抗菌藥物的不合理使用、侵入性操作和住院時間延長等因素有關(guān)[10]。12株耐碳青霉烯類的弗氏檸檬酸桿菌分離自不同年齡(11-80歲)住院患者、不同的標本和分布于多個科室。標本來源包括血液(3株)、痰液(3株)、尿液(4株)和引流液(2株)，其中無菌體液占較大比例(9/12)。上述表明，引起弗氏檸檬酸桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥原因復(fù)雜，呈現(xiàn)多樣性，應(yīng)引起臨床注意。由于是回顧性研究，盡管結(jié)合患者的病例資料、脈沖場凝膠電泳聚類分析數(shù)據(jù)和流行病學(xué)判定這12株之間不存在克隆聚集性，但是，我們不能進一步查找感染源和感染途徑，這有待于以后的研究。

綜上所述，我們研究顯示攜帶blaKPC-2、blaNDM-1和blaIMP-4耐藥基因是這12株弗氏檸檬酸桿菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制，并以產(chǎn)金屬碳青霉烯酶為主(8/12，66.7%)。因此，有必要進一步加強對碳青霉烯類抗菌藥物的管理和重視對腸桿菌科細菌的耐藥監(jiān)測。