閆秀芳，張 鑫，范倩文

（上海家化聯(lián)合股份有限公司 科研部，上海 200080）

熊果苷即4-羥基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，又名熊果甙、熊果素等。目前已知的熊果苷有α-熊果苷、β-熊果苷和脫氧熊果苷。

熊果苷除具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種藥理作用外［1-3］，還是人黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶的抑制劑，熊果苷能有效地抑制皮膚中的生物酪氨酸酶活性，阻斷黑色素的形成，通過自身與酪氨酸酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積，去除色斑和雀斑［4，5］。因熊果苷美白效果好［6］，且毒副作用極?。?］，被廣泛地添加于美白類化妝品中。但由于熊果苷的天然提取物來源少、提取步驟繁多、產(chǎn)量低，故大部分市售熊果苷都是由氫醌轉(zhuǎn)化而成。氫醌有很大的毒副作用，長期使用可引起皮膚外源性黃褐斑和白斑病，其進(jìn)入血液后還會導(dǎo)致皮膚毒性、致癌性、遺傳毒性［8，9］等。若熊果苷中含有殘留的氫醌或者熊果苷分解成的氫醌都會給人體帶來傷害，所以，添加了熊果苷的化妝品的安全性問題一直備受關(guān)注。調(diào)研發(fā)現(xiàn)市場上大部分熊果苷為β-熊果苷，α-熊果苷只有極少數(shù)廠家生產(chǎn)，而且售價是前者的8倍左右。為了模擬市售化妝品，本研究選用β-熊果苷研究其在化妝品中的穩(wěn)定性。

本文以高效液相色譜法測定β-熊果苷分解產(chǎn)生的氫醌的含量為指標(biāo)，來分析不同含量的β-熊果苷水溶液在不同pH、溫度、放置時間以及表皮葡萄球菌（皮膚表面寄生菌群代表）、表皮細(xì)胞等因素對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響。同時研究β-熊果苷原料在不同溫度、不同濕度下的穩(wěn)定性，進(jìn)一步研究維生素C、珍珠粉對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響。以期為今后添加β-熊果苷的水劑、粉劑類美白化妝品的配方設(shè)計、生產(chǎn)、包裝設(shè)計以及存儲和運(yùn)輸提供一定的理論指導(dǎo)作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀，配2487紫外檢測器，美國Waters；XS205電子天平，梅特勒-托利多公司；培養(yǎng)箱，3M集團(tuán)。

β-熊果苷，w≥99.0%，北京貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司；氫醌標(biāo)準(zhǔn)品，w≥99.0%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4），分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸，色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇，色譜純，默克股份兩合公司； 表皮葡萄球菌，ATCC12228，ATCC公司； 表皮細(xì)胞，ATCC公司。

10 mmol/L KH2PO4水溶液配制：取1.36 g KH2PO4于1 L容量瓶中，加水定容至刻度，待用。

1.2 色譜條件

ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動相A為乙腈，流動相B為10 mmol/L KH2PO4水溶液，采用等度洗脫程序（V（A）∶V（B）=5∶95），流動相使用前經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長290 nm。

1.3 不同含量β-熊果苷水溶液以及含β-熊果苷的粉劑類化妝品的穩(wěn)定性考察

不同含量的β-熊果苷水溶液的制備：配制3%，5%和10%的β-熊果苷水溶液。分別將3種不同含量的β-熊果苷水溶液均分成3份，其中2份用磷酸調(diào)節(jié)pH=3和5，然后分別將β-熊果苷原液和pH=3和5的β-熊果苷水溶液分裝成3小瓶，每瓶50 mL。貼好標(biāo)簽，分別存放于25，40和60 ℃的培養(yǎng)箱中。

β-熊果苷原料制備：取β-熊果苷原料，均分成12份，每份15 g，貼好標(biāo)簽，分別存放于 25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中，每個條件下放3瓶做平行試驗(yàn)。

β-熊果苷+維生素C 粉類復(fù)配物樣品制備：配制含2%維生素C+98% β-熊果苷的粉劑類復(fù)配物樣品。均分成12份，每份15 g，貼好標(biāo)簽，分別存放于25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中，每個條件下放3瓶做平行試驗(yàn)。

β-熊果苷+維生素C+珍珠粉粉類復(fù)配物樣品制備：配制2%維生素C+10%珍珠粉+88% β-熊果苷的粉類復(fù)配物樣品。均分成12份，每份15 g，貼好標(biāo)簽，分別存放于25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中，每個條件下放3瓶做平行試驗(yàn)。

1.4 溫度、含量對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

將放置在25，40和60 ℃的培養(yǎng)箱中的含量為3%，5%和10%的β-熊果苷水溶液原液，在不同的時間點(diǎn)1，2，4，8和12周分別取樣1 g至10 mL的比色管中，用 體積比為1∶1的甲醇-水溶液稀釋定容。用高效液相色譜法測定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.5 pH對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

將放置在25，40和60 ℃的培養(yǎng)箱中，不同含量、pH=3和5的β-熊果苷水溶液在不同的時間點(diǎn)1，2，4，8和12周分別取樣1 g至10 mL的比色管，用體積比為1∶1的甲醇-水溶液稀釋定容。用高效液相色譜法測定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.6 表皮葡萄球菌對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

以本單位化妝品為例，β-熊果苷在化妝品中的添加量一般不會大于2%。考慮到實(shí)際化妝品中β-熊果苷的添加量，配制含有0，0.125%，0.5%和2% β-熊果苷的細(xì)菌培養(yǎng)液，均分成3份。其中1份加入表皮葡萄球菌，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。另2份不加菌，分別在4和37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用高效液相色譜法測定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.7 表皮細(xì)胞對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

配制含有β-熊果苷0%，0.125%，0.5%和2%的細(xì)胞培養(yǎng)液，均分成2份。其中一份加入表皮細(xì)胞，另一份不加細(xì)胞。分別在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用高效液相色譜法測定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.8 溫度和濕度對β-熊果苷原料穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

將放置于25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中的β-熊果苷原料分別在不同的時間點(diǎn)1，2，4，8和12周取樣1 g至10 mL的比色管中，用體積比為1∶1的甲醇-水溶液稀釋定容。用高效液相色譜法測定是否有氫醌產(chǎn)生。

1.9 維生素C和珍珠粉對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

維生素C和珍珠粉是美白化妝品中常用的復(fù)配原料，研究含有維生素C、珍珠粉和β-熊果苷的美白粉劑復(fù)配物，發(fā)現(xiàn)三者復(fù)配后，β-熊果苷不穩(wěn)定，有氫醌產(chǎn)生。為進(jìn)一步研究維生素C和珍珠粉對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響，將含有2%維生素C的β-熊果苷以及含有2%維生素C和10%的珍珠粉的β-熊果苷放置于25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度以及40 ℃，75%濕度的培養(yǎng)箱中，分別在1，2，4，8和12周取樣1 g至10 mL的比色管中，用體積比為1∶1的甲醇-水溶液稀釋定容。用高效液相色譜法測定是否有氫醌產(chǎn)生。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度、含量對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響

不同溫度對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響如表1所示。溫度對含量為3%和5%的β-熊果苷水溶液的穩(wěn)定性影響不大，在放置12周時，25 ℃放置溫度條件下，開始檢出氫醌。當(dāng)β-熊果苷水溶液的含量進(jìn)一步增大到10%時，放置在25與60 ℃下，4周時已開始檢測到氫醌，且在60 ℃下，放置12周后，氫醌的含量達(dá)到3 615.3 μg/g。

2.2 pH對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響

不同pH對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響如表1所示。因人體皮膚的pH=5.5左右，護(hù)膚品的pH=4～7，所以未考察堿性條件對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響。由表1可以看出，相同含量、相同溫度下，pH=5時β-熊果苷最穩(wěn)定。pH=3時最不穩(wěn)定。同時發(fā)現(xiàn)3個不同含量的β-熊果苷水溶液，在pH=5，溫度為40 ℃時，放置12周均未產(chǎn)生氫醌。這對β-熊果苷在化妝品膏霜、乳液和化妝水中應(yīng)用時溫度的控制有一定的指導(dǎo)意義。

表 1 溫度、含量和pH對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響Tab.1 Ef fect of temperature， content and pH on the stability ofβ-arbutin aqueous solutions

2.3 表皮葡萄球菌對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響

含β-熊果苷的化妝品涂抹在表皮上，經(jīng)皮膚滲透，β-熊果苷與酪氨酸酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑［4，5］。在人體表皮中有很多表皮細(xì)菌，若β-熊果苷在人體表皮層被細(xì)菌分解，就大大降低了β-熊果苷的美白效果。其中表皮葡萄球菌是皮膚表面常駐菌，且容易培養(yǎng)。如表2所示，以表皮葡萄球菌為例，其在含有不同含量β-熊果苷培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，均未檢測到氫醌，說明表皮葡萄球菌不會導(dǎo)致β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌。

表 2 表皮葡萄球菌對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響Tab.2 Effect of Staphylococcus epidermidis on the stability of β-arbutin aqueous solutions

2.4 表皮細(xì)胞對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響

表皮細(xì)胞對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響見表3。由表3可知，在未添加細(xì)胞的培養(yǎng)液中，24 h后未檢測到氫醌，在有表皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中，隨著培養(yǎng)液中熊果含量的增高，檢測到的氫醌含量也在上升。同時觀察到，表皮細(xì)胞未見死亡，說明在此β-熊果苷分解產(chǎn)生的低含量的氫醌條件下，未產(chǎn)生細(xì)胞毒性。表皮細(xì)胞對β-熊果苷的分解有促進(jìn)作用，這也為護(hù)膚品中β-熊果苷的添加量提供了指導(dǎo)作用。

表 3 表皮細(xì)胞對β-熊果苷水溶液穩(wěn)定性的影響Tab.3 Effect of epidermal cell on the stability of β-arbutin aqueous solutions

2.5 溫度、濕度對β-熊果苷原料穩(wěn)定性的影響

表4為溫度、濕度對β-熊果苷原料穩(wěn)定性的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表4可以看出，在不同的溫度、濕度條件下放置12周后，均未分解產(chǎn)生氫醌。說明β-熊果苷原料在不同的溫度、濕度條件下均很穩(wěn)定。

表 4 溫度、濕度對β-熊果苷原料穩(wěn)定性的影響Tab.4 Effect of temperature and humidity on the stability of β-arbutin

2.6 維生素C和珍珠粉對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響

維生素C對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響如圖1所示。由圖1可知，在25 ℃，20%濕度；40 ℃，18%濕度；60 ℃，15%濕度的條件下放置12周，均未檢出氫醌，在40 ℃，75%的條件下放置，隨著放置時間的延長，釋放的氫醌含量也在升高，12周后氫醌的含量達(dá)到344 μg/g。這一結(jié)果表明在潮濕的環(huán)境中維生素C會促進(jìn)β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌，粉類化妝品β-熊果苷在與維生素C復(fù)配使用時，儲存的環(huán)境要干燥。

圖2為維生素C與珍珠粉對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖2可知，除放置在25 ℃，20%濕度條件下，儲存1周，未檢出氫醌外，其余條件下均有氫醌檢出，且在40 ℃，75%的條件下釋放產(chǎn)生的氫醌達(dá)822 μg/g。分析其原因可能是維生素C在吸濕吸潮的情況下會顯酸性，β-熊果苷在酸性條件下是不穩(wěn)定的。高含量的β-熊果苷粉類化妝品不宜與維生素C、珍珠粉復(fù)配使用。

2.7 討論

本文模擬了β-熊果苷在化妝水中可能的添加量、可能的pH環(huán)境，化妝品穩(wěn)定性考察的加速試驗(yàn)條件（40 ℃，3個月），設(shè)計了含量分別為3%，5%和10%，調(diào)節(jié)pH分別為3、5和原液，放置于25，40和60 ℃ 12周，考察其穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明β-熊果苷的水溶液在弱酸性（pH=5、原液）環(huán)境中，25和40 ℃條件下比較穩(wěn)定；60 ℃條件下，放置4周后，隨著時間的延長，會釋放出氫醌。在酸性（pH=3）環(huán)境中，25 ℃條件下，4周內(nèi)比較穩(wěn)定，4周后，β-熊果苷會分解釋放出氫醌。高溫（40和60 ℃）條件下，1周內(nèi)均有氫醌產(chǎn)生。秦良等［10］考察了0.9%的熊果苷水溶液在pH=1，5.2，8.0，13，室溫下放置3 d的穩(wěn)定性，結(jié)果表明pH=5.2和8.0的0.9%的熊果苷放置3 d是穩(wěn)定的，在pH=1和13時不穩(wěn)定。田宇等［11］的研究結(jié)果表明在化妝水、乳液、膏霜、面膜中添加5%的β-熊果苷，4～45 ℃條件下放置30 d，β-熊果苷在4種劑型中穩(wěn)定性較好。本研究與秦良、田宇等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，同時考察了pH與溫度、放置時間延長到12周，對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，溫度、pH共同作用會影響β-熊果苷的穩(wěn)定性，且隨著放置時間的延長，分解產(chǎn)生的氫醌越多。

本文進(jìn)一步研究了表皮葡萄球菌、表皮細(xì)胞分別與β-熊果苷共孵育24 h，發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌不會導(dǎo)致β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌，表皮細(xì)胞會促進(jìn)β-熊果苷的分解。房軍等［12］研究了人手表皮微生物與β-熊果苷共孵育48 h，發(fā)現(xiàn)β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌。本研究相比于房軍的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究了表皮細(xì)胞對β-熊果苷穩(wěn)定性的影響，同時發(fā)現(xiàn)表皮微生物中的表皮葡萄球菌并沒有導(dǎo)致β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌，分析原因，可能是表皮微生物中的其他菌群促進(jìn)了β-熊果苷的分解。同時本文通過模擬藥物穩(wěn)定性的加速實(shí)驗(yàn)，研究了高溫高濕（40 ℃，75%濕度）條件對β-熊果苷原料、以及添加 了維生素C和珍珠粉后的β-熊果苷原料復(fù)配物穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)β-熊果苷原料在不同溫度、濕度下均很穩(wěn)定，添加了維生素C和珍珠粉的β-熊果苷的穩(wěn)定性會降低。

3 結(jié)論

本文通過高效液相色譜法檢測β-熊果苷水溶液及含有β-熊果苷的粉劑類樣品中是否產(chǎn)生氫醌，來分析β-熊果苷穩(wěn)定性。結(jié)果表明，β-熊果苷水溶液在pH=5，溫度為40 ℃時相對比較穩(wěn)定，pH=3時相對不穩(wěn)定，且隨著放置時間的延長，β-熊果苷分解產(chǎn)生的氫醌越多。同時研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌不會導(dǎo)致β-熊果苷分解產(chǎn)生氫醌。表皮細(xì)胞會促進(jìn)β-熊果苷的分解，且隨著β-熊果苷含量的增加，分解產(chǎn)生的氫醌越多。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)β-熊果苷原料在不同溫度、濕度下均很穩(wěn)定。在β-熊果苷中加入維生素C，珍珠粉等，β-熊果苷的穩(wěn)定性會降低。這一研究對原料儲藏、β-熊果苷在化妝品中使用的添加量以及復(fù)配物的選擇有一定的指導(dǎo)意義。