桂雨豪，孟 瀟，陳慶生，龔盛昭,

（1.廣州環(huán)亞化妝品科技有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東輕工職業(yè)技術學院，廣東 廣州 510300）

化妝品中的防腐體系是化妝品設計中重要的一環(huán)，防腐劑不但能抑制細菌、霉菌和酵母菌的新陳代謝，而且影響其生長和繁殖?；瘖y品中的防腐劑主要從以下幾個方面發(fā)揮作用：破壞微生物細胞壁或抑制微生物細胞壁的形成；影響 細胞膜的功能；抑制蛋白質(zhì)合成和致使蛋白質(zhì)變性［1-3］。隨著社會的發(fā)展以及消費者對于產(chǎn)品安全性要求的不斷提高，傳統(tǒng)防腐劑在化妝品中的安全性問題受到廣泛關注， 消費者更加傾向于溫和、無刺激、環(huán)保的化妝品。

植物精油是從植物的花、葉、莖、根或果實中，通過水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法 或溶劑提取法提煉萃取的揮發(fā)性芳香物質(zhì)，主要由萜烯類、 醛類、醇類、酯類等化學分子構成［4］。研究報道［5］稱，植物精油具有廣譜的抗微生物活性，能夠抑殺細菌、真菌和病毒。由于精油對微生物的作用可能有多個作用位點，因此精油的抗菌作用機制非常復雜［6］?；诖耍疚倪x擇6種化妝品常用精油，探究其在化妝品防腐體系中的作用，為精油的應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

白色假絲酵母菌（ATCC10231）、金黃色葡萄球 菌（ATCC6538）、大腸桿菌（ATCC8739）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）、黑曲霉（ATCC16404），廣東省微生物菌種保藏中心（廣東省微生物研究所）；MH（Mueller Hinton）瓊脂修飾培養(yǎng)基、PDA（Potato Dextrose Agar）修飾培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；肉桂精油、迷迭香精油、檀香精油、玫瑰精油、茶樹精油、甜橙精油，德國DROM公司；甘油，德國EMERY公司；丁二醇，OXEA公司；EDTA-二鈉，荷蘭AKZONOBEL公司；卡波姆，美國LUBRIZOL公司；黃原膠，美國COKELCO公司；氫化聚癸烯，美國MOBIL公司；ARLACEL 165，德國BASF公司；聚二甲基硅氧烷，美國DOW CORING公司；ACNIBIO AP，瑞士CLARIANT公司；綿羊紅細胞懸液，廣州市藥品檢驗所藥理室；潔凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技儀器有限公司；霉菌培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；恒溫恒濕箱，施都凱儀器設備上海有限公司。

其中，實驗所用MH瓊脂修飾培養(yǎng)基是在MH培養(yǎng)基中加入0.5%的Tween-20和1.5%的瓊脂后高溫滅菌配制；PDA修飾培養(yǎng)基是在PDA培養(yǎng)基中加入0.5%的Tween-20后經(jīng)高溫滅菌配制；ARLACEL 165由PEG-100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯組成；ACNIBIO AP由苯氧乙醇、羥苯甲酯、羥苯丁酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯異丁酯組成。

1.2 實驗方法

1.2.1 6種精油的抑菌性試驗

選擇6種精油（玫瑰精油、迷迭香精油、檀香精油、肉桂精油、茶樹精油、甜橙精油）進行抑菌試驗，抑菌試驗按照以下方法進行。

抗細菌活性研究：將MH修飾培養(yǎng)基瓊脂熔化，分別將6種精油加入到MH瓊脂培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基表面與培養(yǎng)皿最上層邊緣高度差值為（3±0.2）mm（可使培養(yǎng)基上層蒸汽壓控制在較高的范圍內(nèi)，最大程度減少精油的揮發(fā)，削弱該因素對實驗產(chǎn)生的不可控影響），再用帕拉膠膜將平皿的邊緣密封好。每種精油均配制成如下體積分數(shù)：0，0.016%，0.032%，0.064%，0.096%，0.128%，0.250%，0.50%和1%。在平皿上每孔分別添加0.2 mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的菌懸浮液，使受檢樣品最終含菌量的數(shù)量級達到105或106CFU/g，每組精油每個體積分數(shù)做3個平行，分別置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在接菌后的第1和7天取樣分析樣品中的菌落含量。

抗真菌活性研究：將PDA修飾培養(yǎng)基熔化，分別將6種精油加入PDA培養(yǎng)基中，使每種精油均配制成如下體積分數(shù)：0，0.016%，0.032%，0.064%，0.096%，0.128%，0.250%，0.50%和1%。在平皿上每孔分別添加0.2 mL黑曲霉、白色假絲酵母的菌懸浮液，使受檢樣品最終含菌量的數(shù)量級達到105或106CFU/g，并用帕拉膠膜將平皿的邊緣密封好，每組精油每個體積分數(shù)做3個平行，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在接菌后的第7和28天取樣分析樣品中的菌落含量。

1.2.2 基礎膏霜的制備

將水相加熱到80 ℃。將防腐劑加入油相中加熱至80 ℃，攪拌至均勻。將油相倒入水相，9 000 r/min乳化3 min，冷 卻至40 ℃后出料。膏霜具體配方如表1所示。

表 1 膏霜基質(zhì)配方Tab.1 The cream formulation

1.2.3 不添加精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)測試

以上述膏霜為基質(zhì)配方，按照0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%的防腐劑添加量進行制作，制作完成后，備用。

實驗參考《中國藥典》（2010年版，二部，附錄XIX N）的微生物性能測試方法，分別用上述添加不同含量防腐劑的樣品挑戰(zhàn)一次加菌的28 d防腐性能測試。稱取受試樣20 g，分別添加0.2 mL混合細菌菌懸液和混合真菌菌懸液，使受檢樣品最終含菌量的數(shù)量級達到105或106CFU/g，攪拌均勻，每組做3個平行試驗。在接菌后的第2，7，14和28天取樣分析樣品中的含菌量。

防腐測試判定標準為：在第7天時細菌菌落總數(shù)要求下降99.9%，在第7，14和28天持續(xù)下降；真菌總數(shù)在第7～28天不再出現(xiàn)。

1.2.4 添加精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)測試

根據(jù)1.2.1試驗方法，選擇具有較好抗菌活性的精油，添加在1.2.3中所述的6種不同防腐劑含量的膏霜配方中，攪拌均勻，備用。挑戰(zhàn)一次加菌的28 d防腐性能測試，試驗菌種、檢測標準、樣品檢測周期、測試方法以及評判標準與1.2.3所述一致。

1.2.5 皮膚刺激性試驗

將未添加精油的膏霜、添加精油的膏霜以及未添加任何防腐劑的空白膏霜進行皮膚刺激性對比試驗。皮膚刺激性的測定是基于人體皮膚表面的脂類和蛋白與紅細胞的細胞膜相似的原理，通過測定從紅細胞中釋放的血紅蛋白量及其變性程度來評價細胞膜和蛋白的損傷，反映皮膚刺激性的大?。?-9］。

具體試驗方法如下：在離心管中分別加入500 μL不同含量（用PBS進行稀釋）的樣品溶液和500 μL 2%（質(zhì)量分數(shù)）的綿羊紅細胞懸液，充分混勻。每個含量梯度均設置3個平行，以PBS為陰性對照（完全不溶血），以100 mg/L的SDS溶液為陽性對照（完全溶血）。置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h后，以2 000 r/min離心3 min，取上清液于酶標儀410，540和575 nm處測定吸光度值A樣品組410/540/575，A陽性對照組410/540/575和A陰性對照組410/540/575。按如下公式分別計算樣品的溶血率和蛋白變性指數(shù)（DI）。

根據(jù)溶血率作圖確定回歸方程，計算測試樣品引起紅細胞50%溶血時的樣品質(zhì)量濃度HC50（mg/L）以及樣品體系分數(shù)為1%時的蛋白質(zhì)變性指數(shù)DI。由HC50值和DI值計算樣品的L/D值：L/D=HC50/DI。依據(jù)歐洲替代方法驗證中心（ECVAM）的Red Blood Cell（RBC）實驗測試方法及分級標準［10］，對測試樣品刺激性程度進行分級，如表2所示。

表 2 化妝品產(chǎn)品刺激性分級標準Tab.2 The classification criteria of skin irritation for cosmetics

2 結果與討論

2.1 6種精油抗菌試驗結果

6種精油的抗細菌最低抑制體積分數(shù)如表3所示，抗真菌最低抑制體積分數(shù)如表4所示。

由表3可以看出，6種精 油中，對于細菌的抑制作用最好的是肉桂精油，甜橙精油、玫瑰精油、檀香精油的抑菌效果相當，迷迭香精油只有微弱的抑菌效果，而茶樹精油在該試驗體積分數(shù)下無抑菌作用，同時，精油對不同類型的細菌抑制效果存在差異，對革蘭氏陽性菌的抑制效果要優(yōu)于革蘭氏陰性菌，可能是因為革蘭氏陰性菌的細胞壁外有一層膜，限制了疏水性物質(zhì)在細胞壁脂多糖中的 擴散。

表 3 6種精油抗細菌最低抑制體積分數(shù)Tab.3 The minimum inhibitory volume fraction against bacteria of six essential oils

表 4 6種精油抗真菌最低抑制體積分數(shù)Tab.4 The minimum inhibitory volume fraction against fungus of six essential oils

由表4可以看出，對于真菌的抑制作用最好的是肉桂精油，其次是甜橙精油和玫瑰精油，迷迭香精油和檀香精油體現(xiàn)出微弱的抑制真菌的作用，茶樹精油在該體積分數(shù)下無抑菌效果。從對霉菌和酵母菌的不同抑制效果可以看出，精油對不同類型的真菌抑制效果存在差異，對酵母菌的抑制效果要優(yōu)于霉菌。

不同類型的精油之間成分存在著較大的差異，肉桂精油中醛類占總含量的87%左右［11］，檀香精油的主要成分是檀香醇［12］，玫瑰精油中香茅醇的含量占90%左右［13］，甜橙精油主要成分是檸檬烯，達到了78%左右［14］，這些成分均能抑制細菌和真菌的生長，主要成分為醛類的精油抑菌效果較好。

2.2 不添加精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)結果

添加6個不同防腐劑含量梯度的膏霜防腐挑戰(zhàn)結果如表5所示。

表 5 不添加精油膏霜防腐挑戰(zhàn)測試結果Tab.5 The anticorrosion challenge test results of the cream without essential oil

由表5可以看出，未添加精油的膏霜在防腐劑含量為0.25%以上才能達到較好的防腐效果。

2.3 添加精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)結果

根據(jù)1.2.1的抑菌試驗，選擇抗菌效果較好的肉桂精油加入1.2.2所述的膏霜體系，考慮到實際生產(chǎn)成本，添加量定為0.01%，配方中其余含量均不變，防腐挑戰(zhàn)結果如表6所示。

對比表5和6可以發(fā)現(xiàn)，當膏霜中不添加任何防腐劑時，只添加0.01%的肉桂精油不能達到安全的防腐效果。當膏霜中添加了0.01%肉桂精油后，防腐劑的含量在0.15%就可以達到良好的防腐效果，這說明在化妝品中添加精油能夠大大降低防腐劑的使用量，精油對防腐劑有協(xié)同增效的作用。而防腐劑是化妝品中主要的過敏源和刺激源，因此，在化妝品中添加精油在降低防腐劑用量的同時也減輕了化妝品過敏、產(chǎn)生刺激的風險。

表 6 添加0.01%肉桂精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)測試結果Tab.6 The anticorrosion challenge test results of the cream with 0.01% cinnamon essential oil

2.4 皮膚刺激性試驗結果

以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標，紅細胞溶血率為縱坐標作圖并確定回歸方程。根據(jù)回歸方程確定樣品引起紅細胞50%溶血時的質(zhì)量濃度HC50，同時計算出1%樣品體積分數(shù)下的蛋白質(zhì)變性指數(shù)DI，得出L/D，根據(jù)表2，確定樣品的刺激程度，試驗結果如表7所示。

表 7 皮膚刺激性試驗結果Tab.7 The results of skin irritation test

由L/D值可以看出，未添加任何防腐劑和精油的膏霜刺激性最低，添加了0.25%防腐劑而未添加精油的膏霜有輕微的刺激性，在膏霜中添加0.01%精油降低了膏霜中防腐劑的使用量，因此其L/D＞100，無刺激性，這說明在化妝品中精油的抑菌效果在降低防腐劑用量的同時，也降低了化妝品的刺激性。對比樣品1和樣品3，樣品3的L/D值比樣品1低，這說明精油對皮膚具有輕微的刺激性。

3 結論

通過研究6種精油的抗菌性，發(fā)現(xiàn)對細菌抑制作用最好的是肉桂精油，甜橙精油、玫瑰精油、檀香精油的抑菌效果相當，另外，精油對革蘭氏陽性菌的抑制作用要優(yōu)于革蘭氏陰性菌。對真菌抑制作用最好的是肉桂精油，其次是甜橙精油和玫瑰精油，迷迭香精油和檀香精油體現(xiàn)出微弱的抑制真菌的作用，精油對不同類型的真菌的抑菌性也存在差異，對酵母菌的抑菌性要優(yōu)于霉菌。精油的抗菌性與其化學成分有很大的關系，主要成分為醛、醇類的精油大多具有好的抑菌作用。

通過對比未添加精油的膏霜和添加0.01%肉桂精油膏霜的防腐挑戰(zhàn)試驗，發(fā)現(xiàn)在膏霜中添加0.01%的肉桂精油可以有效地降低膏霜中防腐劑使用量。通過皮膚刺激性試驗，發(fā)現(xiàn)在均能通過防腐測試的前提下，添加了0.01%肉桂精油和0.15%防腐劑的膏霜L/D值為112.26，而只添加了0.25%防腐劑的膏霜L/D值為58.53，說明在化妝品中添加精油，在降低了防腐劑用量的同時，也降低了化妝品的刺激性。但是，當防腐劑用量均為0.15%時，添加了0.01%肉桂精油的膏霜L/D值比未添加的膏霜L/D值略低，這說明精油本身具有輕微的刺激性。