徐素華 楊 琳 吳冰冰 孫衛(wèi)華 陸 煒 王慧君 程國強(qiáng) 周文浩

遺傳代謝病(IMD)是一組病種繁多的單基因病，新生兒期發(fā)病的IMD往往病情危重，但部分患兒經(jīng)及時(shí)精準(zhǔn)干預(yù)，預(yù)后會得以改善[1]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可同時(shí)對多種代謝物進(jìn)行快速檢測，是目前臨床常用的檢測IMD的方法，但其檢測病種有限，檢測結(jié)果易受患兒病情和治療等多種因素影響，可造成一定的誤診及漏診[2]。高通量測序(NGS)通過對多個(gè)基因進(jìn)行檢測而提供可靠的分子診斷，能彌補(bǔ)質(zhì)譜技術(shù)的不足[3]。目前尚缺乏大樣本的關(guān)于NGS和質(zhì)譜檢測對NICU中IMD高?；純汉Y查效能的研究。

1 方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 以包含2 742個(gè)已知致病基因捕獲的NGS為金標(biāo)準(zhǔn)，以包含20種氨基酸代謝病、12種脂肪酸代謝病和19種有機(jī)酸代謝病的質(zhì)譜(質(zhì)譜液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜-質(zhì)譜檢查)檢測為待測標(biāo)準(zhǔn)，對NICU中IMD高?；純盒羞z傳代謝病篩查，比較NGS和質(zhì)譜的篩查效能。

1.2 檢測人群納入標(biāo)準(zhǔn) 同時(shí)符合以下2條：①2016年8月至2018年6月復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)納入新生兒基因組計(jì)劃的(ClinicalTrials.gov注冊號: NCT02551081)、臨床表現(xiàn)疑似IMD的高危兒；②患兒監(jiān)護(hù)人對質(zhì)譜檢測和NGS篩查IMD簽署書面知情同意書。

1.3 檢測人群排除標(biāo)準(zhǔn) 符合以下任意1條：①具有特殊面容的患兒；②影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)神經(jīng)、心血管、消化、或泌尿生殖系統(tǒng)存在明確結(jié)構(gòu)畸形；③住院時(shí)間<12 h即自動出院或死亡。

1.4 目的基因捕獲的NGS及陽性結(jié)果分類

1.4.1 檢測方法 選用Agilent ClearSeq Inherited Disease試劑盒(包含2 742個(gè)已知致病基因)。測序?qū)嶒?yàn)采用Illumina Hiseq 平臺，與人類參考基因組序列比對，98%的目標(biāo)捕獲區(qū)域測序深度大于20×。變異采用VEP軟件(Variant Effect Predictor, Ensembl 73)進(jìn)行注釋。3個(gè)主要的收錄已知或疑似致病變異的數(shù)據(jù)庫ClinVar、OMIM和HGMD用于篩選已知的致病變異，同時(shí)采用多種工具預(yù)測預(yù)測錯義變異的危害性、注釋非編碼區(qū)序列等。基于人群的大規(guī)模測序數(shù)據(jù)庫用于排除在正常人群中具有較高頻率的變異。變異使用Clinic Sequence Analyzer(CSA，WuXi NextCODE)進(jìn)行評估，并依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對每個(gè)變異進(jìn)行分類。變異按照人類基因組變異協(xié)會(HGVS)規(guī)則進(jìn)行命名。陽性變異采用Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.2 基因檢測陽性病例分類 樣本基因檢測數(shù)據(jù)分析由我院分子診斷中心經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床信息分析人員完成后，與臨床醫(yī)生共同確定樣本的最終分子遺傳學(xué)診斷[4, 5]。將基因檢測陽性病例分為IMD和非IMD的遺傳性疾病。

1.5 質(zhì)譜檢測及異常判斷

1.5.1 血氨基酸、?；鈮A譜和尿有機(jī)酸譜檢測 用一次性采血針采集患兒手指或足跟的末梢血，滴于專用采血濾紙片上，經(jīng)含有氨基酸和?；鈮A內(nèi)標(biāo)的有機(jī)溶劑萃取、鹽酸正丁醇衍生后，用LC-MS/MS儀進(jìn)行血氨基酸和?；鈮A譜分析。同時(shí)留取患兒清潔尿標(biāo)本，經(jīng)肌酐含量測定校正和鹽酸羥胺、氫氧化鈉、鹽酸處理，加入內(nèi)標(biāo)并經(jīng)有機(jī)溶劑萃取、甲基硅烷化衍生后，用GC-MS儀進(jìn)行尿有機(jī)酸譜分析。質(zhì)譜檢測結(jié)果由我院質(zhì)譜室專業(yè)技術(shù)人員，根據(jù)患兒血、尿代謝譜的變化，結(jié)合患兒臨床資料分析判斷，將質(zhì)譜檢測異常結(jié)果分為提示IMD可能和提示繼發(fā)性改變可能。遺傳代謝病的特異性代謝標(biāo)志物見表1。

1.5.2 質(zhì)譜檢測可篩查的IMD疾病譜 見表2。

1.6 金標(biāo)準(zhǔn)、待測標(biāo)準(zhǔn)檢測和報(bào)告時(shí)間 同時(shí)采集IMD高危兒血和尿，行質(zhì)譜和NGS檢測。質(zhì)譜檢測結(jié)果1周內(nèi)獲得，NGS診斷周期3周左右。

1.7 臨床信息采集 本研究的目的是比較NGS和質(zhì)譜檢測對遺傳代謝病的篩查效能，故非IMD不在本文進(jìn)一步討論。故僅收集基因檢測診斷為IMD患兒的人口學(xué)信息(性別、檢測年齡、家族史)，臨床癥狀與體征，其他實(shí)驗(yàn)室輔助檢測(血氨、血糖、血乳酸等)，確診后患兒臨床診療方案的改變情況，并電話隨訪IMD患兒的近期結(jié)局。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以NGS結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)四格表計(jì)算質(zhì)譜檢測結(jié)果診斷IMD的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及其95%CI。

表1 遺傳代謝病的特異性代謝標(biāo)志物

注 Phe：苯丙氨酸；Tyr：酪氨酸；Leu：亮氨酸；Val：纈氨酸；Met：蛋氨酸；Cit:瓜氨酸；Arg：精氨酸；Orn：鳥氨酸；Gly：甘氨酸；GAA：胍基乙酸；Cr：肌酸；Pro：脯氨酸；Lys：賴氨酸；His：組氨酸；Xle：氧代脯氨酸；C0：游離肉堿；C16：棕櫚酰肉堿；C18：硬酯酰肉堿；C18:1：硬酯烯酰肉堿；C4：丁酰肉堿；C3：丙酰肉堿；C4-OH：羥基丁酰肉堿；C8：辛酰肉堿；C10：癸酰肉堿；C14-OH：羥十四酰肉堿；C16-OH：羥棕櫚酰肉堿；C18-OH：羥硬酯酰肉堿；C14:1：十四烯酰肉堿；C14：十四酰肉堿；C10:2：癸二烯肉堿；C2：乙酰肉堿；C3DC：丙二酰肉堿；C5：戊/異戊酰肉堿；C5DC：戊二酰肉堿；C5:1：戊烯酰肉堿；C5-OH：羥戊酰肉堿；C6DC：己二酰肉堿

表2 質(zhì)譜檢測可篩查的遺傳代謝病疾病譜

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的2 000例IMD高危新生兒進(jìn)入本文分析，男1 131例(56.6%)，女869例。早產(chǎn)兒670例(33.5%)。神經(jīng)系統(tǒng)主要表現(xiàn)為意識改變、驚厥發(fā)作和肌張力異常(增高或降低)594例(29.7%)；呼吸系統(tǒng)主要表現(xiàn)為不明原因的呼吸困難和反復(fù)發(fā)紺818例(40.9%)；消化系統(tǒng)主要表現(xiàn)為反復(fù)嘔吐、持續(xù)黃疸、肝功能異常和體重增長不滿意858例(42.9%)；代謝和電解質(zhì)系統(tǒng)主要表現(xiàn)為持續(xù)低血糖、嚴(yán)重代謝性酸中毒、高血氨、電解質(zhì)紊亂和高乳酸血癥382例(19.1%)；循環(huán)系統(tǒng)和感染主要表現(xiàn)為不明原因休克、嚴(yán)重持續(xù)感染814例(40.7%)。

2.2 NGS結(jié)果 2 000例IMD高危新生兒中NGS檢測到明確致病變異的病例217例(10.9%)，其中IMD 33例(1.7%)，非IMD 184例。33例IMD中，錯義變異32個(gè)，無義變異8個(gè)，移碼變異12個(gè)，剪切位點(diǎn)變異5個(gè)，片段雜合缺失2個(gè)。其中收錄在HGMD數(shù)據(jù)庫中的變異有27個(gè)。

2.3 質(zhì)譜檢測結(jié)果 2 000例IMD高危新生兒中質(zhì)譜結(jié)果異常154例(7.7%)，提示繼發(fā)性改變可能128例，提示IMD可能26例。提示IMD可能的26例中，有機(jī)酸代謝病11例、氨基酸代謝病9例、脂肪酸代謝病6例。

表3顯示，以NGS檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)譜檢測待測標(biāo)準(zhǔn)1(提示IMD可能+提示繼發(fā)性改變可能)為陽性結(jié)果，質(zhì)譜檢測的敏感度93.9%(95%CI：79.8%～99.3%)，特異度93.8%(95%CI：92.6%～94.8%)，陽性預(yù)測值20.1%(95%CI：17.2%～23.4%)，陰性預(yù)測值99.9%(95%CI：99.6%～100%)。以質(zhì)譜檢測待測標(biāo)準(zhǔn)2(提示IMD可能)為陽性結(jié)果，質(zhì)譜檢測的敏感度78.8%(95%CI：61.1%～91.0%)，特異度100%(95%CI：99.8%～100%)，陽性預(yù)測值100%，陰性預(yù)測值為99.7%(95%CI：99.3%～99.8%)。

2.4 質(zhì)譜檢測與NGS結(jié)果比較

表3 2 000例IMD高危兒NGS和質(zhì)譜檢測篩查四格表

注 待測標(biāo)準(zhǔn)1：質(zhì)譜提示IMD可能+提示繼發(fā)性改變可能，待測標(biāo)準(zhǔn)2：質(zhì)譜提示IMD可能

2.4.2 質(zhì)譜檢測待測標(biāo)準(zhǔn)1中，假陰性2例 質(zhì)譜結(jié)果正常的1 846例中，NGS發(fā)現(xiàn)2例IMD。例1：男嬰，年齡14 d，因“納奶差伴反應(yīng)欠佳1 d”于我院就診，查體：四肢肌張力低下，患兒生后因“低血糖、黃疸”在外院治療。臨床考慮IMD可能，質(zhì)譜檢測結(jié)果正常，NGS發(fā)現(xiàn)UPB1基因有致病/可疑致病變異，變異位點(diǎn)c.91G>A(p.G31S)和c.977G>A(p.R326Q)，診斷β-脲基丙酸酶缺乏癥(OMIM 613161)，該病屬于嘧啶代謝異常，影響嘧啶分解代謝，尿液中可出現(xiàn)脲基丙酸鹽、脲基異丁酸鹽異常升高。例2：男嬰，4 d，因“皮膚黃染3 d，青紫1次”于我院就診，生化檢查提示代謝性酸中毒和高膽紅素血癥，臨床考慮IMD可能，質(zhì)譜檢測結(jié)果正常，NGS發(fā)現(xiàn)MOCS1基因有致病/可疑致病變異，變異位點(diǎn)c.199C>T(p.R67W)和c.45delG(p.A17Qfs*79)，診斷鉬輔因子缺乏癥A型(OMIM 252150)，因影響鉬輔因子依賴的酶類活性，而導(dǎo)致嘌呤、硫等代謝障礙，可出現(xiàn)血清尿酸水平降低及尿液中亞硫酸鹽水平升高。值得說明的是，這2種疾病不包含在本文質(zhì)譜檢測的病種中。

2.5 NGS確診IMD患兒的臨床特征 NGS診斷IMD 33例，男性19例，女性14例，NGS檢測時(shí)年齡1～33 d。確診為21種IMD，有機(jī)酸代謝異常8種15例(45.5%)、氨基酸代謝異常7種9例(27.3%)、脂肪酸氧化代謝異常3種6例(18.2%)，其他類型IMD共3例(9%)?；純褐饕R床表現(xiàn)，消化系統(tǒng)：納差、拒奶、嘔吐，呼吸系統(tǒng)：呼吸暫停、呼吸困難，神經(jīng)系統(tǒng)：反應(yīng)欠佳、驚厥發(fā)作、四肢肌張力異常；實(shí)驗(yàn)室檢查以代謝性酸中毒、血氨水平升高和低血糖為主?；純杭易迨分性型蛳嗨婆R床表現(xiàn)或不明原因?qū)е滦律鷥浩谒劳觯?或)伴有其母不明原因自然流產(chǎn)或死胎等12例(36.4%)。

3 討論

新生兒期發(fā)病的IMD病情危重，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，難以及時(shí)診斷和干預(yù)，是新生兒死亡的主要原因之一[6, 7]。MS/MS能對血樣本中多種氨基酸和?；鈮A進(jìn)行快速定量檢測。美國率先應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行新生兒疾病篩查[8]。我國由上海兒科研究所于2002年開展串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的新生兒疾病篩查，截至目前，國內(nèi)近80個(gè)實(shí)驗(yàn)室開展了新生兒IMD篩查。但因各地區(qū)社會特征、疾病研究背景、經(jīng)濟(jì)狀況的不同，篩查的IMD疾病種類從幾種到幾十種不等[9]。我院結(jié)合血液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和尿氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對51種IMD進(jìn)行篩查，通過與NGS測序結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，有5/33例(15.2%)NGS檢測出的代謝性疾病未包含在質(zhì)譜篩查的疾病譜中，故仍需不斷完善質(zhì)譜檢測的IMD疾病譜，以便在尚不能進(jìn)行基因檢測的地區(qū)完善質(zhì)譜篩查。

并不是所有的遺傳代謝病均會在新生兒期起病。但是對于這類疾病，如能早期診斷，在發(fā)病前進(jìn)行正規(guī)的評估隨診，避免誘發(fā)因素，可延緩發(fā)病，在出現(xiàn)癥狀時(shí)能及時(shí)針對性治療，能改善預(yù)后。本研究中，質(zhì)譜檢測范圍內(nèi)有2例患兒提示為繼發(fā)性改變可能，但NGS檢測到IMD的致病/可疑致病變異。者2例分別診斷為5-羥脯氨酸酶缺乏癥和希特林缺乏所致新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥。這2種疾病，均可在新生兒期無明顯臨床表現(xiàn)，早期質(zhì)譜篩查可無明確異常。但是，如早期診斷，可以有針對性地進(jìn)行隨訪和定期的評估，從而改善患兒的長期預(yù)后。目前國內(nèi)外關(guān)于5-羥脯氨酸酶缺乏癥病例報(bào)告十分有限，對于該病的診斷和長期隨訪可豐富該病臨床表型，加深認(rèn)識[10]。對于希特林缺乏所致新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒，通過飲食調(diào)整及對癥治療，可能改善預(yù)后[11]。

由于人體代謝途徑為一極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，許多代謝途徑相互交叉，質(zhì)譜結(jié)果易受患兒飲食、病情、治療和檢測時(shí)間等因素的影響，特別是對于許多代謝途徑并不旺盛的新生兒，某些IMD特異性的代謝物水平可能無明顯升高[2]。在本研究中，2/33例患兒(6.1%)通過NGS測序糾正了質(zhì)譜檢測的結(jié)果。1例為MEGDEL綜合征，又稱3-甲基戊烯二酸尿癥Ⅳ型。該病患兒體內(nèi)3-甲基戊烯二酸水平變化程度極大。而研究中患兒代謝紊亂表現(xiàn)與該病導(dǎo)致磷脂重塑缺陷而繼發(fā)線粒體功能障礙，從而影響體內(nèi)其他物質(zhì)在線粒體中的代謝過程有關(guān)。1例為鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥,該患兒臨床表現(xiàn)較重，合并驚厥、低血糖及肝功能受損表現(xiàn)，可能出現(xiàn)繼發(fā)的代謝紊亂，從而造成結(jié)果判讀的困難。本研究中，有11/33例患兒(33.3%)通過NGS測序細(xì)化了疾病類型，這對于此類疾病的針對病因的精準(zhǔn)治療，也是至關(guān)重要的。

目前廣泛用于臨床檢測的全外顯子組測序、臨床外顯子組測序，因其涵蓋疾病譜廣、不依賴于典型的臨床表現(xiàn)，使得很多的新生兒期遺傳相關(guān)疾病得到了早期的診斷。需要指出的是，這類檢測是針對于編碼區(qū)及剪接位點(diǎn)，較深的內(nèi)含子的致病變異并不在其捕獲范圍之內(nèi)。此外，對于基因內(nèi)的缺失，也不是所有的檢測機(jī)構(gòu)都能通過數(shù)據(jù)分析的完善而進(jìn)行識別。例如，本研究中所提及的希特林缺乏所致新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患兒包含1個(gè)SLC25A13基因內(nèi)的0.2 kb的缺失，我院的NGS數(shù)據(jù)分析流程在升級后可以進(jìn)行此類拷貝數(shù)水平的檢測和注釋[5]，但是常規(guī)的NGS分析方法可能會漏掉這類變異的發(fā)現(xiàn)。故而，在這種情況下，雖然NGS檢測疾病譜遠(yuǎn)大于質(zhì)譜檢測，但是對于代謝性疾病，從DNA水平及代謝物水平進(jìn)行綜合評估，才能最大程度地提高診斷的準(zhǔn)確性。

本文的不足：①本文未將串聯(lián)質(zhì)譜檢測范圍外的代謝性疾病，如糖原累積病、過氧化物酶體病等，列入IMD疾病進(jìn)行比較；②本文僅針對納入的2 000例高危新生兒中NGS診斷明確的患兒，進(jìn)行了臨床及2種檢測結(jié)果的比較及分析；③本研究在單中心進(jìn)行，結(jié)果可能存在地區(qū)的特異性。

綜上所述，本研究提出，需要進(jìn)一步通過多中心大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，不斷完善IMD疾病譜，以此為依據(jù)在尚不能進(jìn)行基因檢測的地區(qū)完善質(zhì)譜篩查的檢測病種；在有條件的地區(qū)，需要將NGS和質(zhì)譜檢測結(jié)合，在新生兒期對于臨床異質(zhì)性高、表型錯綜復(fù)雜的代謝性疾病的高危兒進(jìn)行更為積極的檢測及評估。