王輝,曾曉房,馮衛(wèi)華,于立梅, 翟萬京, 白衛(wèi)東,曾令鋼

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州，510550) 2(廣東中興綠豐發(fā)展有限公司，廣東 河源，517000)

檸檬苦素是含呋喃的三萜類化合物，分子式為C26H30O8，是一種具有高度生物活性的植物次生代謝產(chǎn)物[1],包括檸檬苦素糖苷和檸檬苦素糖苷配體在內(nèi)的一系列化合物，已經(jīng)分離和鑒定的檸檬苦素類化合物約50多種[2]。檸檬苦素具有抗癌活性、抑制HIV、鎮(zhèn)痛抗炎作用、抗焦慮鎮(zhèn)靜作用、調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平、防止動脈粥樣硬化形成、防蟲殺蟲活性、抗氧化活性和抑菌活性等功能[3-4]。章斌等[5]的研究表明，檸檬苦素對細菌有較好的抑菌活性。檸檬苦素在柑橘類植物的種子和皮中含量非常豐富，但目前國內(nèi)對檸檬的加工利用大部分局限于檸檬鮮果、檸檬果汁及檸檬精油等，也有少部分拓展到加工檸檬凍干片及檸檬護膚品等，因此每年產(chǎn)生大量檸檬果皮廢棄物[6]。如果檸檬果皮中的檸檬苦素能得到大量合理利用，提高其提取效率和使用途徑，將具有廣闊的工業(yè)前景。青霉廣泛分布于自然界中，少數(shù)青霉種類能引發(fā)人體與動物的各類疾病，而多數(shù)青霉能造成柑桔、蘋果、梨等水果的腐爛，青霉病是水果腐爛的最主要原因之一[7-8]。

因此，本文以青霉作為研究對象，探討檸檬苦素對青霉的抑菌活性以及進行抑菌機理的研究。為開發(fā)檸檬苦素作為天然抑菌劑應用于食品領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器設(shè)備

檸檬皮粉，廣東中興綠豐發(fā)展有限公司；青霉(Penicilliumsp.)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillusniger)由仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院微生物實驗室保藏；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體(PDB)培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；檸檬苦素標準品(純度99.98%)，濟寧天之藍生物科技有限公司；堿性磷酸酶試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；考馬斯亮藍-G250、蒽酮，北京索萊寶科技有限公司；福林試劑(分析純)，Sigma公司；石油醚、二氯甲烷及無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

掃描電子顯微鏡(JEOL-6360LV型)、冷凍干燥儀(JFD-320型)、離子濺射儀(JFC-1600型)，日本電子株式會社；精密數(shù)字式電導率儀(DDS-18A型)，上海日島科學儀器有限公司；凈化工作臺(SW-CJ-1FD型)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱(PYX-280S-A型)，韶關(guān)市科力實驗儀器有限公司；紫外分光光度計(UV-759型)，上海橫搖科技有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器(DSX-280型)，上海申安醫(yī)療器械廠；冷凍水浴恒溫振蕩器(THZ-82型)，金壇市中大儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(XHRE-52A型)，鄭州豫華儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

檸檬皮中檸檬苦素溶液的制備：按照課題組前期的提取方法[9]，得到檸檬苦素結(jié)晶后，用少量15%乙醇溶解制成檸檬苦素溶液，-18 ℃保藏。

菌種活化和孢子懸浮液的制備：將保存在-20 ℃的青霉菌種在PDA培養(yǎng)基上活化2次后，用無菌生理鹽水將孢子洗脫，制成孢子含量為108個/mL的孢子懸浮液，4 ℃冰箱保藏，備用。

檸檬苦素抑制青霉活性的測定：最低抑菌濃度(minimum inhibibory concentration, MIC)和最小殺菌濃度(minimum fungicidal concentration, MFC)的測定參考王巍等[10]和任先偉等[11]的方法，并略作修改。分別采用試管法和平板法測定檸檬苦素的MIC和MFC。取10支無菌試管，采用倍半濃度稀釋法使8支試管中檸檬苦素質(zhì)量濃度為10 000～78.125 μg/mL，1支試管為空白對照，不接種菌液，1支試管為菌液對照組，以等量無菌水代替檸檬苦素溶液。28 ℃培養(yǎng)2 d后，以試管中無青霉生長的最低檸檬苦素濃度為其MIC。MIC測定后，在無菌生長的試管中各取100 μL涂布于PDA平板培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d后，以平板培養(yǎng)基上無菌生長的最低檸檬苦素濃度為MFC。

(1)

(2)

菌落間距/mm=菌落間距平均值-打孔器直徑

(3)

(4)

1.3 檸檬苦素抑制青霉的機理

對青霉菌絲體總糖含量的測定：將青霉孢子懸液接種于PDB培養(yǎng)基，28 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后，加入質(zhì)量濃度為0、156.25、312.5、625、1 250、2 500 μg/mL的檸檬苦素溶液，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 d后，過濾得青霉菌絲，用蒸餾水沖洗菌絲數(shù)遍后用濾紙吸干。按照蒽銅比色法[14]測定菌絲含糖量。以加入等量15%乙醇作為對照。

對青霉胞外可溶性蛋白含量的測定：將青霉孢子懸液接種于PDB培養(yǎng)基，加入檸檬苦素使其最終濃度為MIC后，28 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、8、16、24、32、40 h移取孢子懸浮液，1 000 r/min離心10 min，取上清液0.1 mL，采用考馬斯亮藍G-250 比色法[15]測定蛋白質(zhì)的含量。以加入等量15%乙醇作為對照。

對青霉胞外堿性磷酸酶(AKP)活力的測定：將青霉孢子懸液接種于PDB培養(yǎng)基，加入檸檬苦素使其最終濃度為MIC后，于28 ℃下150 r/min振蕩孵育0、2、4、6、8、10 h后，1 000 r/min離心10 min，取上清液按照AKP試劑盒比色法測定和計算AKP活力[16]。以加入等量15%乙醇作為對照。

掃描電鏡觀察青霉菌絲體和孢子：取100 μL 106個/mL的青霉孢子懸浮液涂布在PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，用打孔器制得直徑為4 mm的菌餅，將菌餅倒置在含有2倍MIC檸檬苦素的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h。用無菌的鑷子將平板上的菌絲刮下后，經(jīng)固定、脫水、干燥、噴金后鏡檢[17]。以加入等量15%乙醇作為對照。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

每個測定均重復3次。結(jié)果表示為平均值±標準偏差。應用SPSS 22.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)中的One-Way ANOVA對所有數(shù)據(jù)進行方差分析，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬苦素對3種霉菌的MIC和MFC影響

經(jīng)試管法和平板法試驗測定，檸檬苦素對3種霉菌的MIC和MFC結(jié)果見表1。檸檬苦素對青霉的抑制活性最強，黑曲霉次之，根霉最弱。周夢嬌等[12]研究了中草藥對青霉的抑菌活性，其中抑菌活性最強的桂枝提取物對青霉的MIC和MFC為6.25和12.50 mg/mL，相比可知，檸檬苦素對青霉的抑菌活性很強。

表1檸檬苦素對霉菌的MIC及MFC單位：μg/mL

Table 1 The MIC and MFC of limonoids against mould

2.2 對青霉菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，檸檬苦素對青霉菌絲生長抑制的EC50值較小。由圖1可知，檸檬苦素質(zhì)量濃度為78.125 μg/mL時，對菌絲生長的抑制率已達44.20%，對孢子萌發(fā)的抑制率僅為27.00%；但隨質(zhì)量濃度升高至MIC(625 μg/mL)時，對孢子萌發(fā)的抑制率大于對菌絲生長的抑制率，并隨質(zhì)量濃度升高，兩者差值越大。當檸檬苦素質(zhì)量濃度達到2 500 μg/mL時，對青霉菌絲生長的抑制率和對青霉孢子萌發(fā)的抑制率分別為87.56%和98.31%，已基本完全抑制青霉孢子的萌發(fā)。因此，低濃度檸檬苦素對青霉菌絲生長具有較好的抑制效果，但高濃度檸檬苦素對青霉孢子萌發(fā)的抑制效果更佳。

表2 檸檬苦素對青霉的毒力回歸方程和EC50Table 2 Virulence regression equation and EC50 oflimonoids against Penicillium

圖1 檸檬苦素對青霉的菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制率Fig.1 Inhibition rate of limonoids on mycelium growth and spore germination of Penicillium

2.3 檸檬苦素抑制青霉的機理

2.3.1 對細胞膜通透性的影響

2.3.1.1 對菌絲體總糖含量的影響

當細胞膜膜結(jié)構(gòu)遭到破壞時，細胞內(nèi)容物包括糖類會發(fā)生外泄。菌絲體總糖含量的變化，可以反映細菌膜結(jié)構(gòu)的完整性[18]。由圖2可知，隨檸檬苦素質(zhì)量濃度增大，青霉菌絲體總糖含量顯著下降(P<0.05)，但下降趨勢逐漸放緩。當檸檬苦素質(zhì)量濃度為MIC(625 μg/mL)時，菌絲體內(nèi)總糖僅為未受檸檬苦素溶液處理的59.39%；當檸檬苦素質(zhì)量濃度為MFC(2 500 μg/mL)時，菌絲體內(nèi)總糖為未受檸檬苦素溶液處理的45.73%。因此，檸檬苦素可以對青霉細胞膜造成破壞，使菌體內(nèi)總糖外滲，且處理濃度越大，破壞性越強。以上結(jié)論與周夢嬌等[12]關(guān)于中草藥能破壞指狀青霉細胞結(jié)構(gòu)，導致菌絲中總糖含量下降，從而達到抑菌效果的結(jié)論一致。

圖2 檸檬苦素對青霉菌絲總糖含量的影響Fig.2 Effects of limonoids on total sugar content ofPenicillium注：不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05。

2.3.1.2 對胞外可溶性蛋白的影響

微生物生物膜的磷脂雙分子層內(nèi)鑲嵌有大量蛋白質(zhì)分子。當磷脂雙層遭到破壞時，膜上的蛋白質(zhì)將流到細胞外，且胞內(nèi)的蛋白質(zhì)也會流出。測定菌液中的蛋白質(zhì)含量，可以看出磷脂雙分子層是否被破壞[19]。由圖3可知，經(jīng)檸檬苦素處理的青霉菌液中蛋白質(zhì)含量顯著高于CK組(P<0.05)。檸檬苦素作用于青霉菌液后，作用時間為16 h內(nèi)，尤其是前8 h，菌液中的蛋白質(zhì)含量迅速上升，16 h后破壞作用趨于穩(wěn)定。說明檸檬苦素在16 h時基本完成了對細胞膜破壞，導致蛋白質(zhì)大量泄漏，影響青霉代謝活動的進行[20]。

圖3 檸檬苦素對青霉胞外可溶性蛋白質(zhì)的影響Fig.3 Effect of limonoids on extracellular soluble protein of Penicillium

2.3.2 對細胞壁完整度的影響

真菌細胞壁是一層重要而堅韌的保護層，在細胞壁和細胞膜之間存在一種叫堿性磷酸酶(AKP)的物質(zhì)，正常情況下無法在胞外檢測到該種酶的活性。一旦細胞壁遭到破壞，AKP將滲出至胞外。因此可以通過檢測胞外AKP活力的變化來說明細胞壁的透性是否發(fā)生改變[21-22]。由圖4可知，經(jīng)MIC檸檬苦素處理的青霉培養(yǎng)液中AKP活力明顯高于CK組(P<0.05)。MIC檸檬苦素作用后4 h內(nèi)，菌液中滲出的AKP活力顯著增強(P<0.05)。因此，檸檬苦素對青霉細胞壁的作用很快產(chǎn)生，4 h內(nèi)基本破壞了青霉細胞壁，致使AKP酶外泄。

圖4 檸檬苦素對青霉胞外AKP酶活力的影響Fig.4 Effect of limonoids on the activity of extracellular AKP enzyme in Penicillium

2.3.3 對菌絲和孢子形態(tài)的影響

由圖5可知，經(jīng)2倍MIC檸檬苦素(2×MIC)處理后的青霉形態(tài)與CK組相比發(fā)生較為明顯的變化。CK組的青霉孢子(圖5-A)呈現(xiàn)完整的球形，形態(tài)規(guī)則而飽滿；而2×MIC組的青霉孢子(圖5-B)欠飽滿，有明顯的皺縮和變形，外部附著溶出物。

圖5 青霉掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopy (SEM) of Penicillium

CK組分生孢子梗、?；?、小梗和分生孢子(圖5-C)完好且生長旺盛；而2×MIC組的青霉(圖5-D)可觀察到，分生孢子生長不旺盛，小梗、分生孢子呈現(xiàn)明顯的凹陷，嚴重皺縮和變形，各部分均有明顯附著溶出物，可能是細胞凹裂而流出的物質(zhì)。試驗中也觀察到青霉菌絲變細，其生長受到抑制，但不是很明顯。這與檸檬苦素對抑制青霉活性的研究結(jié)果以及對細胞壁、細胞膜的影響結(jié)果一致。

3 結(jié)論

檸檬苦素對青霉有強抑菌活性。其抑制青霉的MIC值和MFC值分別為625和2 500 μg/mL；抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50值分別為85.618 μg/mL和246.755 μg/mL。高濃度檸檬苦素對青霉孢子的萌發(fā)有較強的抑制作用，并能有效抑制菌絲生長。因此，檸檬苦素可以作為青霉抑菌劑加以應用。

檸檬苦素在較短的時間內(nèi)迅速破壞了青霉細胞膜和細胞壁的完整性，并在4 h和16 h基本完成對青霉細胞膜和細胞壁的破壞，造成大量內(nèi)容物滲出；而且檸檬苦素的濃度越高，內(nèi)容物滲出量越大，即破壞性越大。掃描電鏡觀察到2×MIC檸檬苦素處理后，青霉的分生孢子生長不旺盛；孢子和小梗、分生孢子呈現(xiàn)明顯的凹陷、嚴重皺縮和變形，有明顯胞內(nèi)物質(zhì)溶出；菌絲形態(tài)也發(fā)生了一定程度的變化。這些變化影響了青霉胞內(nèi)的正常代謝，進而抑制了青霉的生長和繁殖。