BMP4和SMAD4基因在公綿羊繁殖相關(guān)組織的表達(dá)

采復(fù)拉·大木拉 ，田志龍 ，段新華 ，儲(chǔ)明星

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，烏魯木齊 830000；3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471003）

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族可以調(diào)節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，影響動(dòng)物的胚胎發(fā)育、器官形成以及細(xì)胞外基質(zhì)合成和穩(wěn)態(tài)［1］。近些年研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β超家族對(duì)胚胎原始生殖細(xì)胞形成［2］、睪丸發(fā)育、生殖細(xì)胞增殖分化［3］、動(dòng)物出生后睪丸正常功能維持［4］、精子生成等過(guò)程發(fā)揮著重要的生理調(diào)控作用。BMP4基因作為TGF-β超家族成員，參與多種生命活動(dòng)，促進(jìn)小鼠精原干細(xì)胞的分化［3］。Smad4蛋白是TGF-β超家族的常見(jiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與TGF-β超家族所有成員的信號(hào)傳導(dǎo)。Smad4在小鼠睪丸中表達(dá)，并且被認(rèn)為在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用［5］。目前，對(duì)于BMP4和SMAD4的研究比較多，但BMP4和SMAD4基因?qū)d羊繁殖性狀的作用模式還未確定。因此，本研究以低繁殖力蘇尼特羊公羊和高繁殖力小尾寒羊公綿羊?yàn)樵囼?yàn)材料，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)BMP4和SMAD4基因在不同繁殖力公羊下丘腦-垂體-睪丸軸等組織中的表達(dá)，以探索BMP4和SMAD4基因在公綿羊繁殖中的作用，為深入理解公綿羊繁殖機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

小尾寒羊來(lái)自山東省鄆城縣大鵬農(nóng)牧科技有限公司，蘇尼特羊來(lái)自內(nèi)蒙古烏拉特中旗。從中隨機(jī)挑選性成熟且健康狀況良好的公羊各3只。屠宰后分別采集大腦、小腦、下丘腦、垂體、輸精管、腎上腺、睪丸和附睪組織，液氮中保存直至提取RNA。RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司（北京），反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量染料均購(gòu)于大連寶生物；2×Taq PCR Master Mix購(gòu)于拓英坊科技有限公司（北京）。

1.2 RNA提取和檢測(cè)

使用試劑盒提取組織總RNA（詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)），使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，利用儀器測(cè)定其純度和濃度。

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物。以RPL19基因做內(nèi)參基因。引物具體信息見(jiàn)表1。

表1 綿羊BMP4、SMAD4和RPL19基因的引物序列和產(chǎn)物大小

1.4 熒光定量PCR

試驗(yàn)用cDNA合成及RT-PCR和熒光定量PCR試驗(yàn)過(guò)程參考文獻(xiàn) ［6］。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供步驟進(jìn)行cNDA的合成，使用2×Taq PCR Master Mix對(duì)目的基因進(jìn)行PCR，最后使用SYBR?PremixExTaqTMⅡ進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理參考文獻(xiàn)［6］，即以 RPL19 為內(nèi)參基因，使用 2-△△CT法［7］計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，使用鄧肯氏（Duncan's）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與cDNA合成

利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA完整性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，RNA完整性良好。使用內(nèi)參基因?qū)DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖1），目的片段與預(yù)期的一致，可用于后續(xù)的熒光定量試驗(yàn)。

圖1 cDNA電泳檢測(cè)

2.2 BMP4和SMAD4基因在不同品種公羊繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

運(yùn)用qPCR對(duì)小尾寒羊公羊和蘇尼特羊公羊8種繁殖相關(guān)組織中BMP4和SMAD4基因的表達(dá)量進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)圖2。兩個(gè)品種比較發(fā)現(xiàn)，BMP4和SMAD4在公綿羊各種組織中均有表達(dá)，其中BMP4基因在睪丸中高表達(dá)，其次是輸精管、腎上腺，在其他組織中均呈痕量表達(dá)。SMAD4基因在睪丸、下丘腦、小腦、大腦中高表達(dá)，在其他組織中均中等表達(dá)。BMP4基因在低繁殖力蘇尼特公羊睪丸中表達(dá)量顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05）。SMAD4基因在低繁殖力蘇尼特公羊8種組織表達(dá)量均顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05）。

圖2 BMP4和SMAD4基因在不同品種公羊繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

3 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族中最大的一個(gè)亞家族［8］。BMP4是BMP亞家族中的重要成員之一，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用。在生殖系統(tǒng)調(diào)節(jié)中，睪丸和卵巢是BMP4作用的重要靶器官［9］。研究發(fā)現(xiàn)，BMP4不但可促進(jìn)初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)化為次級(jí)卵泡［10］，還可促進(jìn)牛卵巢原始卵泡以及次級(jí)卵泡直徑的增加并調(diào)控牛卵母細(xì)胞成熟［11］。徐業(yè)芬［12］發(fā)現(xiàn)，BMP4抗體處理湖羊卵母細(xì)胞可以導(dǎo)致其凋亡并消失。推測(cè)BMP4基因是原始卵泡和卵母細(xì)胞生存必需因子，可促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)一步分化，排卵卵泡進(jìn)一步成熟，最終表現(xiàn)為排卵數(shù)增加。BMP4基因不僅在綿羊卵巢中發(fā)揮作用，還在山羊中也發(fā)揮著重要功能［13］。秦立紅等［14］報(bào)道，BMP4基因在草原紅牛不同發(fā)育時(shí)期睪丸組織中均有表達(dá)，這說(shuō)明BMP4基因在草原紅牛睪丸組織中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP4基因在低繁殖力蘇尼特公羊睪丸中表達(dá)量顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05），這和前人研究結(jié)果基本一致。

TGF-β超家族信號(hào)通路在卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)以及顆粒細(xì)胞增殖、哺乳動(dòng)物睪丸發(fā)育及精子形成中起重要作用。Smad4作為該信號(hào)通路的中心分子在TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵作用［15］。王玉恒等［16］研究發(fā)現(xiàn)，Smad4在牦牛的多個(gè)組織中均有表達(dá)，尤其是在生殖系統(tǒng)的卵巢、輸卵管、子宮組織中廣泛表達(dá)。郝曉霞［17］研究發(fā)現(xiàn)，Smad4在小鼠睪丸支持細(xì)胞、萊氏細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和除長(zhǎng)形精子之外的所有生殖細(xì)胞中表達(dá)。在支持細(xì)胞中敲除Smad4能夠影響胎兒睪丸索擴(kuò)張，單獨(dú)敲除萊氏細(xì)胞中的Smad4對(duì)胎兒及成年鼠睪丸發(fā)育無(wú)影響。在支持細(xì)胞和萊氏細(xì)胞中同時(shí)敲除Smad4，能夠?qū)е滦∈蟛G丸不育和腫瘤形成。高真真［18］使用免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Smad4在成年鵪鶉和雞的睪丸生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞中高表達(dá)。本研究表明，SMAD4基因在睪丸、下丘腦、小腦、大腦中高表達(dá)，且低繁殖力蘇尼特羊公羊顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05），再次驗(yàn)證了SMAD4基因?qū)τ诓G丸功能以及相關(guān)繁殖組織的重要作用。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，BMP4和SMAD4基因在小尾寒羊公羊和蘇尼特羊公羊睪丸中高表達(dá)，并且在蘇尼特羊睪丸中的表達(dá)量顯著高于小尾寒羊（P＜0.05）。表明BMP4和SMAD4基因在公綿羊繁殖中起一定程度的負(fù)調(diào)控作用，這為公綿羊高繁殖性狀選育提供了參考依據(jù)。