許 京，葉 迎，王瑞海，苗 青，王 震，聶穎蘭，劉麗梅△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

紅芪為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand. -Mass. 的干燥根。黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao 或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. 的干燥根[1]。紅芪在甘肅的宕昌、武都、隴西、岷縣等地均廣泛栽培,其產(chǎn)量約占全國的95%以上[2]。黃芪產(chǎn)于甘肅的品質(zhì)好，被譽(yù)為“隴芪”[3]。作為傳統(tǒng)中藥，二者均具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、脫毒排膿、斂瘡生肌的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，紅芪和黃芪含有一定相同或相似的黃酮和皂苷類化合物[4-5]，并在抗氧化[6]、調(diào)節(jié)免疫功能[7]、保肝[8]和保護(hù)心腦血管[9]等諸多方面具有顯著療效。在歷版《中華人民共和國藥典》中，1977、1995年版將紅芪列為正品黃芪之一，1985、2005、2010、2015年版均將二者分列。在西南、西北地區(qū)有以紅芪代黃芪入藥的習(xí)俗[10]，但紅芪和黃芪是否可以替代使用尚無系統(tǒng)的研究。血液作為中藥成分在體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)的樞紐，絕大多數(shù)成分借助血液分布到作用部位或受體部位，而一部分成分在血漿中與生物大分子蛋白結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮作用[11]。為深入研究其藥理作用差異，可以通過入血成分的分析，檢測血清中含有藥材成分，推斷可能發(fā)揮藥效的成分[12]。目前已有黃芪血清移行成分研究的報(bào)道[13]，但紅芪血清移行成分、紅芪和黃芪血清移行成分對比研究未見報(bào)道。因此，本文從血清移行成分入手，開展紅芪、黃芪對比研究，為紅芪和黃芪是否可以替代使用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫6320液相-離子肼質(zhì)譜聯(lián)用(LC-TRAP-MS)系統(tǒng)，包括電噴霧離子源(ESI)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，數(shù)據(jù)采集與處理采用6300 Series Ion Trap LC/MS Software 6.1工作站。SatoriusBT25S電子天平，Stuart SBHCONC/1氮吹儀，Millipore Intergral 3 純水儀，昆山KQ-500DE型超聲波清洗儀，上海安亭科學(xué)儀器廠Anke TDL-5-A低速臺式離心機(jī)，安亭TGL-16 GB高速離心機(jī)，Gene G560E漩渦式混勻儀。

1.2 試劑與藥品

乙腈、甲酸均為色譜純，購自迪馬公司；乙酸乙酯為色譜純，購自Fisher公司，超純水為自制。對照品：黃芪皂苷I(批號14011302)、黃芪皂苷II(批號13062004)、異黃芪皂苷II(批號13051404)購自成都普思生物科技股份有限公司；黃芪甲苷對照品(批號H-013-140729)，購自北京盛世康普化工技術(shù)研究院；熊果酸對照品(批號110742-200516)，購自中國藥品生物制品檢定所；黃芪皂苷III(批號20160317)，購自上海將來實(shí)業(yè)有限公司；大豆皂苷I(批號15121104)，購自盈澤納新化工技術(shù)研究院；毛蕊異黃酮對照品(批號13081501)、芒柄花苷對照品(批號13081501)購自成都普思生物科技股份有限公司；毛蕊異黃酮苷對照品(批號20141109)，購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；芒柄花素對照品(批號111703-200603)，購自中國食品藥品檢定研究院。藥材：紅芪、黃芪藥材采于甘肅，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所胡世林研究員鑒定為2015版《中華人民共和國藥典》收載的正品紅芪和黃芪。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±20) g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號SCXK-(軍)2012-0004。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 紅芪和黃芪動(dòng)物給藥樣品制備[14]取紅芪和黃芪藥材飲片各200 g，1000 mL 70% 乙醇回流提取2次，每次2 h，減壓干燥、粉碎得提取物紅芪70.51 g，黃芪63.25 g。各取紅芪和黃芪藥材提取物適量，加蒸餾水配制成含生藥1.5 g/mL大鼠灌胃藥液。

2.1.2 含藥血清制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)數(shù)日。實(shí)驗(yàn)前禁食約12 h，自由飲水。取 SD 大鼠12只，隨機(jī)分成紅芪組和黃芪組，按30 g/kg體質(zhì)量灌胃，在給藥0、15、30、60、120、240、360、480、600 min時(shí)眼眶各采血0.5 mL，3500 rpm離心10 min，吸取上部血清，同組血清合并置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 供試品溶液的制備 取1 mL血清，加10 mL乙酸乙酯，渦旋5 min，12000 rpm離心10 min，吸取上清、氮吹，以0.1 mL 70% 甲醇復(fù)溶，12000 rpm離心10 min，制得血清樣品。取“2.1.1”項(xiàng)下的灌胃藥液，1: 10加入甲醇溶液，超聲30 min，5000 rpm離心10 min，吸取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，得紅芪和黃芪樣品。

2.1.4 對照品溶液配制 精密稱取各對照品適量，分別甲醇溶解配制成1 mg/mL對照品溶液，精密量取各對照品溶液50 μL至同一5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容，得10 μg/mL混合對照品溶液，作為混合對照品儲(chǔ)備液保存于4 ℃冰箱。

2.2 液相條件和質(zhì)譜條件[15-16]

2.2.1 液相條件 色譜柱Dikma Leapsil C18(100×2.1 mm，2.7 μm)，流動(dòng)相為：A，水(含0.1%甲酸)，B，乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脫0 min，20% B，0 ～ 5 min，20% ～ 40% B，5 ～ 15 min，40% ～ 54% B，15 ～ 20 min，54% ～ 65% B，20 ～ 30 min，65% ～ 90% B，30 ～ 31 min，90% ～ 100% B，31 ～ 33 min，100% B。流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，負(fù)離子檢測。離子源條件為干燥器溫度(Gas Temp)350 ℃，干燥氣流量10 L/min，霧化器壓力45 psi，毛細(xì)管電壓4500 V，掃描范圍100 ～ 1500 m/z。

3 結(jié)果

3.1 紅芪、黃芪入血成分鑒別[17-20]

圖1～3表1顯示，由LC-TRAP-MS分析得到紅芪及黃芪灌胃藥液、空白血清、含藥血清總離子流圖和不同溶劑處理含藥血清及混合對照品溶液提取離子流圖，用工作站軟件導(dǎo)出及一定處理。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照或由分子離子峰、文獻(xiàn)報(bào)道的多級質(zhì)譜碎片信息對比分析，推測出多數(shù)色譜峰的可能組成，灌胃藥液中一共鑒定出成分24個(gè)，其中紅芪18個(gè)，黃芪22個(gè)，二者相同成分16個(gè)，不同成分8個(gè)，由色譜峰響應(yīng)值可判斷二者相同成分含量不一樣。

3.2 紅芪及黃芪血清中移行成分分析

對比紅芪、黃芪與其相應(yīng)含藥血清的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，大鼠口服紅芪或黃芪后吸收入血成分較多，但較內(nèi)源性成分的電離程度弱。本實(shí)驗(yàn)通過EIC模式提取含藥血清中來源于紅芪、黃芪中的相應(yīng)成分，對比對照品和紅芪、黃芪總離子流質(zhì)譜指紋圖的保留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)吸收入血成分13個(gè)，其中紅芪9個(gè)，黃芪13個(gè)， 差異4個(gè)(Kaempfrol-4’-methether-3-β-D-glucoside、Isomucronulatol-7,2'-di-O-glucoside/(3S)- mucronulatol-7-O-β-D- glucoside、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ)。圖4、5顯示紅芪、黃芪吸收血成分變化。紅芪入血成分隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，成分個(gè)數(shù)減少較大，表明紅芪入血成分種類變化較大；黃芪入血成分隨時(shí)間推移有減少但相對平穩(wěn)，表明黃芪入血成分種類變化較小。

表1 紅芪、黃芪灌胃藥液中黃酮及皂苷類成分定性鑒別

注：*下—級質(zhì)譜測試所選定的母離子，acetylxyl乙酰基木糖 xyl木糖 glc葡萄糖；——表示未檢測到該成分，+表示含有少量該成分(EIC峰高響應(yīng)值數(shù)量級105)，++、+++和++++表示隨峰高響應(yīng)值數(shù)量級增加含量依次增加

注：A. 紅芪；B. 黃芪圖1 灌胃藥液總離子流圖(TIC)

注：A. 紅芪組空白血清；B. 黃芪組空白血清；C. 紅芪60 min含藥血清；D. 黃芪60 min含藥血清圖2 空白血清與含藥血清總離子流圖(TIC)

注：A. 乙腈；B. 甲醇；C. 乙酸乙酯；D. 正丁醇；E. 對照品溶液1.毛蕊異黃酮苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊異黃酮；4.黃芪甲苷；5.黃芪皂苷Ⅲ ；6.芒柄花素；7.黃芪皂苷II；8.大豆皂苷I；9.異黃芪皂苷II；10.黃芪皂苷I圖3 不同溶劑處理含藥血清及混合對照品溶液提取離子流圖(EIC)

峰號保留時(shí)間(min)(-)MS成分鑒定15 min30 min60 min90 min120 min240 min360 min480 min600 min黃芪紅芪黃芪紅芪黃芪紅芪黃芪紅芪黃芪紅芪黃芪紅芪黃芪紅芪黃芪紅芪黃芪紅芪11.7481.1491.1毛蕊異黃酮苷++++++++++++++++++++—+—22.5/4.3625.4661.4671.4Isomucronulatol-7,2’-di-O-glucoside+—+—+—+—+—+—+—+———44.7465.1475.1芒柄花苷+++++++++++++++++++++++++55.3497.7507.7Kaempfrol-4’-methether-3-β-D-glucoside++—+++—+++—++—++—++—++—+—+—65.6463.0499.0509.0Isomucronulatol-7,2'-di-O-glucoside/(3S)- mucronulatol-7-O-β-D- glucoside+++++++++++++++—++—+—+—+—+—75.8283.1毛蕊異黃酮+++++++++++++++++—137.5819.5829.5黃芪甲苷++—++—++—++—++—++—++—++—++—147.6819.5829.5黃芪皂苷Ⅲ+—+—+—+———————————168.4267.1芒柄花素++++++++++++++++++++++++++178.4861.5871.5黃芪皂苷II+++—+++—+++—+++++++++++++++++—++—++—199.1861.5871.5異黃芪皂苷II++—+++—+++—+++—++++++++—++—++—2110.9903.1913.1黃芪皂苷I+++++++++++++++++++++++++++++2211.8903.1913.1異黃芪皂苷I+++++++++++++++++++—+—+—

注：—表示未檢測到該成分，+：表示含有少量該成分(EIC峰高響應(yīng)值數(shù)量級105)，++、+++和++++：表示隨峰高響應(yīng)值數(shù)量級增加含量依次增加

4 討論

4.1 樣品提取方法的確定

參考黃芪水提取、醇提取最佳提取工藝研究文獻(xiàn)[21-24]，分別采用水提取(10倍量，煮取2次，每次1.5 h)和70%乙醇提取(10倍量，回流提取2次，每次2 h)制備樣品，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，70%乙醇提取樣品入血成分?jǐn)?shù)量多、峰面積大，因此，采用70%醇提取樣品。

4.2 血清樣品處理方法考察

實(shí)驗(yàn)考察了4種血清處理方法，取450 μL空白血加入10 μg/mL混標(biāo)溶液，50 μL配成1 μg/mL含藥血清共4份，分別加入1.5 mL甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正丁醇渦旋混勻12000 rpm離心10 min，取上清氮吹，以0.1 mL 70%甲醇復(fù)溶，12000 rpm離心10 min，制得4份血清樣品。4種溶劑對4種黃酮類成分提取無明顯差異，甲醇、乙腈和正丁醇對黃芪甲苷和大豆皂苷I提取率較乙酸乙酯高，而乙酸乙酯對黃芪皂苷II、異黃芪皂苷II及黃芪皂苷I的提取率要高于其他3種溶劑，乙酸乙酯提取可有效檢測到全部10種化合物，最終選取乙酸乙酯萃取法作為樣品處理方法。

4.3 應(yīng)用LC-MS技術(shù)檢測血清中移行成分

本實(shí)驗(yàn)采用LC-TRAP-MS進(jìn)行血中移行成分檢測。大鼠口服紅芪或黃芪后血清中內(nèi)源性成分的電離程度強(qiáng)，對入血成分影響較大。故本實(shí)驗(yàn)采取EIC模式提取含藥血清中來源于黃芪及紅芪中的相應(yīng)成分，通過比對二者在相同保留時(shí)間處色譜峰的質(zhì)譜圖，同時(shí)參考文獻(xiàn)推測血清中微量的移行成分。采用LC-TRAP-MS技術(shù)，結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確，為闡明紅芪和黃芪藥入血成分(可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ))的研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

圖4 紅芪不同采血點(diǎn)血中移行成分

圖5 黃芪不同采血點(diǎn)血中移行成分

LC-TRAP-MS檢測靈敏度為104，本實(shí)驗(yàn)中檢測不到成分并不代表血中沒有，但一些成分由于技術(shù)要求難以鑒別，或其含量太低無法檢測。因此，本文所報(bào)道的紅芪、黃芪血中移行成分的差異是在此條件下的研究結(jié)果。

4.4 紅芪、黃芪入血成分的對比分析

圖4、5顯示，紅芪入血成分隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，成分個(gè)數(shù)減少較多，表明紅芪入血成分種類變化較大；黃芪入血成分隨時(shí)間推移有減少，但相對平穩(wěn)，表明黃芪入血成分種類變化較小。

綜上，從紅芪、黃芪血中的移行成分分析，二者有一定的共有成分，可能有相近的功效，但血中不同移行成分較多且血中成分隨時(shí)間推移變化差異較大，為《中華人民共和國藥典》將紅芪和黃芪分別列為2個(gè)品種提供了一定的科學(xué)依據(jù)。因此，建議紅芪、黃芪不宜相互替代使用。