劉文康，馮桃花，柴亞男，郝 娟，武 寧，許慶友,2，王 箏,2△，王香婷,2△

(1. 河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050091； 2. 河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 石家莊 050091)

慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)是全球主要的公共健康問題，嚴(yán)重危害人類的身體健康。女性作為CKD的高發(fā)人群(發(fā)病率12.9%)，其妊娠面臨著重大挑戰(zhàn)[1]。妊娠是加重慢性腎臟病損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]，不僅對(duì)母體產(chǎn)生損傷，還會(huì)影響新生兒質(zhì)量，且相關(guān)的腎臟疾患都有不同程度的加重[3]。

在前期研究化瘀滌痰通絡(luò)中藥抑制細(xì)胞增殖的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)單側(cè)輸尿管梗阻可激活醛固酮(aldosterone，ALD)，介導(dǎo)炎性損傷、刺激腎臟固有細(xì)胞增殖、膠原沉積等多種病理反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎纖維化進(jìn)展[4]。在此基礎(chǔ)上，本研究以“腎脾虧虛，濁毒內(nèi)蘊(yùn)”為病機(jī)，以妊娠合并單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral occlusion，UUO)為動(dòng)物模型，以醛固酮活化-SGK-1/NF-κB-細(xì)胞增殖-ECM積聚為途徑，給予醛固酮受體阻斷劑及益腎健脾瀉濁中藥治療，初步探討其抑制醛固酮活化、下調(diào)SGK-1/NF-κB表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖、保護(hù)腎功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性未經(jīng)產(chǎn)Wistar大鼠90只，雄性Wistar 大鼠20只，8周齡，體質(zhì)量(160±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方案充分考慮安全和公平的原則，研究過(guò)程中涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均符合國(guó)家對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有關(guān)要求。

1.2 藥物

螺內(nèi)酯片(杭州民生藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)T18B040)。益腎健脾瀉濁方組成：黃芪 20 g，當(dāng)歸 5 g，山藥 15 g，山茱萸 15 g，土茯苓 20 g，澤瀉 15 g，白芍 12 g，懷牛膝 12 g。神威藥業(yè)免煎中藥配方顆粒(生產(chǎn)批號(hào)17103061，17102361，17062111，17081151，17061251，17091411，17032651，17060421)，混勻煎煮15 min。

1.3 主要試劑與儀器

Cr試劑盒貝克、BUN試劑盒(曼庫(kù)爾特公司，生產(chǎn)批號(hào)AUZ3562，AUZ3611)；ALd試劑盒、Progesterone試劑盒、Estradiol試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物公司，生產(chǎn)批號(hào)RA21810，RG51805，RG61805)；PCNA(proteintech公司，生產(chǎn)批號(hào)00044915)； SGK-1、GAPDH(Affinity 公司，生產(chǎn)批號(hào)19U71，AB54162)；NF-kB p65 (servicebio公司生產(chǎn)批號(hào)181905)；免疫組化通用SP試劑盒(中杉金橋生物公司，生產(chǎn)批號(hào)K185910G)。γ-放射免疫計(jì)數(shù)器FJ-2021(西安二六二廠)；小型垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad公司)；顯微照相儀、病理圖文分析系統(tǒng)DP72CCD，BX53顯微鏡(Olympus公司)。

1.4 模型建立及分組

雌性未經(jīng)產(chǎn)Wistar大鼠90只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham)、假手術(shù)+妊娠組(SP)、UUO組(UUO)、UUO+妊娠組(UP)、UUO+妊娠+螺內(nèi)酯組(SPI)、UUO+妊娠+中藥組(TCM)，每組各15只。UUO組采用UUO手術(shù)復(fù)制慢性腎病腎間質(zhì)纖維化模型，水合氯醛注射麻醉，切開腹部分離左側(cè)輸尿管，于上下1/3處結(jié)扎后剪斷，縫合腹部。假手術(shù)組僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷。UUO術(shù)后，SPI組大鼠給予螺內(nèi)酯50 mg/kg/d灌胃[5]，TCM組大鼠給予益腎健脾瀉濁中藥3.11 g/kg/d 灌胃(結(jié)合文獻(xiàn)記載[6-8]，本實(shí)驗(yàn)大鼠處于妊娠前后，用法用量應(yīng)適度，藥物的藥力達(dá)到祛除大半病邪即可，故采用低劑量給藥)，每天1次。UUO術(shù)后第9周，對(duì)SP組、UP組、SPI組、TCM組大鼠進(jìn)行陰道涂片，觀察動(dòng)情周期。在動(dòng)情前期及動(dòng)情期，雌雄大鼠以1∶1比例進(jìn)行合籠并密切觀察，發(fā)現(xiàn)陰栓之日確定為妊娠第1天。妊娠雌鼠稱體質(zhì)量，單獨(dú)飼養(yǎng)。妊娠第18天將大鼠放入代謝籠，留取24 h尿。次日處死母鼠，股動(dòng)脈留取全血離心取血清，摘取健側(cè)腎臟，部分置于4%多聚甲醛，部分腎組織-70 ℃保存。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.5.1 腎臟組織形態(tài)學(xué)改變 腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度脫水、包埋，切片厚度4 μm，行HE、Masson染色。

1.5.2 各組大鼠腎功能 血清肌酐(Scr) 和尿肌酐(Ucr)采用苦味酸法測(cè)定，尿素氮(BUN)采用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測(cè)定，按試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)，內(nèi)生肌酐清除率=尿肌酐×24 h尿量/血肌酐/1440。

1.5.3 各組大鼠血清醛固酮水平 放射免疫法測(cè)定血清醛固酮含量，采用液相平衡競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法。125I標(biāo)記抗原(×Ag)與未標(biāo)記抗原(Ag)競(jìng)爭(zhēng)限量抗體(Ab)上的結(jié)合位點(diǎn)。制備樣品，配置標(biāo)準(zhǔn)品，孔內(nèi)分別加入樣本、標(biāo)記物、抗體，充分混勻37 ℃靜置1.5 h，加入分離劑充分混勻，4 ℃ 3600/r離心20 min，棄上清測(cè)量沉淀物cpm。計(jì)算復(fù)管靜計(jì)數(shù)的平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.5.4 各組大鼠妊產(chǎn)情況及血清孕酮、雌二醇含量 UUO術(shù)后第9周開始觀察SP組、UP組、SPI組、TCM組大鼠動(dòng)情周期，合籠后記錄見陰栓情況。妊娠結(jié)束前處死母鼠，觀察大鼠見栓懷孕率、產(chǎn)仔數(shù)、死胎數(shù)、流產(chǎn)胎數(shù)，留取大鼠股動(dòng)脈血，檢測(cè)血清孕酮(progesterone，P)、雌二醇(estradiol,E2)含量。

1.5.5 免疫組化檢測(cè)腎臟組織SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達(dá) 采用SABC法檢測(cè)，切片，梯度脫水，抗原修復(fù)，加一抗SGK-1、NF-κB、PCNA(濃度均為1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗，PBS清洗，滴加SABC復(fù)合物，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。以鏡下出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5.6 Western blot 檢測(cè)腎臟SGK-1、NF-κB、PCNA的蛋白表達(dá) 將100 g腎臟組織剪碎勻漿、裂解組織蛋白、定量，20～60 μg蛋白上樣，90 V電泳2 h半干轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗鼠一抗SGK-1(1∶1000)、PCNA(1∶1000)、NF-κB(1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗，羊抗兔二抗(均為1∶20000)，TBST清洗后顯影成像。以GAPDH 作為內(nèi)參校正，并利用Image J系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，比較目的條帶/內(nèi)參條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變

圖1顯示，HE、Masson染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)清楚，小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，間質(zhì)無(wú)水腫，少量纖維成分表達(dá)。UUO造模各組大鼠腎小管擴(kuò)張明顯，小管間質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)纖維化明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，UP組較UUO組損傷更為嚴(yán)重。SPI組和TCM組大鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原沉積情況較UUO組明顯減輕。

注：擴(kuò)張的腎小管；炎性細(xì)胞；膠原纖維圖1 大鼠腎臟組織HE、Masson病理改變(×400)

2.2 各組大鼠腎功能情況

表1顯示，與假手術(shù)組比較UUO各組大鼠BUN、Scr明顯升高，肌酐清除率明顯降低(P<0.01)，UP組改變更明顯；螺內(nèi)酯及中藥組大鼠尿素氮、血肌酐水平有所降低(P<0.05,P<0.01)，Ccr明顯升高(P<0.01)。

表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮、肌酐清除率

注：與sham組比較：**P<0.01；與SP組比較：▲▲P<0.01；與UUO組比較：■P<0.05，■■P<0.01； 與UP 組比較：▽▽P<0.01

2.3 各組大鼠血清醛固酮水平

表2顯示，與假手術(shù)組比較，UUO各組大鼠血清醛固酮含量顯著升高(P<0.01)；與SP 組比較，UUO組及UP組表達(dá)明顯增高(P<0.01)；SPI組及TCM組大鼠血清醛固酮含量較UP組明顯降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠血清醛固酮、孕酮及雌二醇水平比較

注：與sham組比較：**P<0.01；與SP組比較：▲▲P<0.01；與UUO組比較：■P<0.05，■■P<0.01；與UP 組比較：▽P<0.05，▽▽P<0.01

2.4 各組大鼠妊產(chǎn)情況及血清孕酮、雌二醇含量

表3顯示，觀察發(fā)現(xiàn)SP組大鼠動(dòng)情周期規(guī)律，見栓率高；UP組多數(shù)大鼠動(dòng)情周期紊亂，部分甚至出現(xiàn)嚴(yán)重陰道炎癥，見栓率低；SPI組、TCM組部分大鼠也出現(xiàn)周期紊亂的現(xiàn)象，見栓率也相對(duì)較低。SP組大鼠見栓懷孕率高、產(chǎn)仔數(shù)高、不完全流產(chǎn)情況很少出現(xiàn)，平均產(chǎn)仔數(shù)多；UP組見栓懷孕率低，不完全流產(chǎn)情況嚴(yán)重，平均產(chǎn)仔數(shù)明顯減少；SPI組、TCM組見栓懷孕率較UP組高，大鼠產(chǎn)仔數(shù)較高，不完全流產(chǎn)情況相對(duì)減少，平均產(chǎn)仔數(shù)相對(duì)較多。

表3 各組大鼠妊產(chǎn)情況比較

注：1.見栓雌鼠是指雌雄合籠后見到陰栓的雌鼠數(shù)；2.見栓懷孕雌鼠指確定懷孕雌鼠數(shù)目，即=足月產(chǎn)雌鼠+不完全流產(chǎn)雌鼠；3.不完全流產(chǎn)情況是指雌鼠孕有多胎小鼠，少數(shù)仔鼠未能存活至分娩，在妊娠期間已胎停育，而大多數(shù)仔鼠能正常娩出；4.全組大鼠平均產(chǎn)仔數(shù)=全組所有大鼠所孕育成熟胎鼠數(shù)/見栓雌鼠；5.組內(nèi)孕鼠平均產(chǎn)仔數(shù)=全組所有大鼠所孕育成熟胎鼠數(shù)/見栓懷孕雌鼠

表2顯示，與S組、U組比較，SP組、UP組、SPI組、TCM組大鼠血清P、E2表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；其中SP組表達(dá)水平最高，UP組表達(dá)相對(duì)較低，SPI組、TCM組P、E2水平高于UP組大鼠(P<0.05，P<0.01)。

2.5 免疫組化檢測(cè)腎臟組織SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達(dá)

圖 2顯示，假手術(shù)組大鼠腎臟SGK-1、NF-κB、PCNA呈弱表達(dá)，主要見于遠(yuǎn)端腎小管；UUO造模各組上述指標(biāo)表達(dá)均明顯增強(qiáng)，UP組表達(dá)高于UUO組。SPI組和TCM組表達(dá)范圍及強(qiáng)度較UUO組均明顯減弱。

注：SGK-1、NF-κB、PCNA 在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)比較假手術(shù)組大鼠腎臟SGK-1、NF-κB、PCNA呈弱表達(dá)，主要見于遠(yuǎn)端腎小管；UUO造模各組上述指標(biāo)表達(dá)均明顯增強(qiáng)，UP組表達(dá)高于UUO組圖2 免疫組化檢測(cè)各組大鼠腎臟組織SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達(dá)(×400)

2.6 Western blot 檢測(cè)腎組織SGK-1、NF-κB、PCNA的蛋白表達(dá)

圖3顯示，與假手術(shù)組及SP組比較，UUO各組大鼠SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05,P<0.01)，UP組PCNA的表達(dá)高于U組(P<0.05)，螺內(nèi)酯及中藥可下調(diào)其表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。

注：與Sham組比較：#P<0.05，##P<0.01；與SP組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與UUO組比較：■P<0.05；與UP組比較:▽P<0.05，▽▽P<0.01圖3 Western blot檢測(cè)對(duì)照組及模型組大鼠腎臟SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達(dá)比較

3 討論

近年來(lái)，慢性腎臟病的發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，育齡婦女為0.1%～3%[9]。妊娠使CKD患者原有腎臟病變加重，腎小球硬化和玻璃樣變，出現(xiàn)重度貧血和子癇的幾率明顯增加[10-11]。有研究表明，CKD患者在妊娠晚期出現(xiàn)妊娠期高血壓病與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活密切相關(guān)[12]，其下游效應(yīng)分子醛固酮作用更為重要。在腎臟損傷和妊娠的雙重作用下，RAAS系統(tǒng)失衡進(jìn)而誘導(dǎo)醛固酮合成增多?；罨娜┕掏赏ㄟ^(guò)SGK-1/NF-κB 信號(hào)通路引起炎性損傷進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度增殖[13]，增殖的細(xì)胞分泌 ECM 參與間質(zhì)纖維化進(jìn)展。前期研究證實(shí)，腎臟損傷可誘導(dǎo)醛固酮活化，通過(guò)SGK-1信號(hào)通路刺激腎小管上皮細(xì)胞增殖，參與腎纖維化進(jìn)展。給予醛固酮受體阻斷劑依普利酮可抑制醛固酮活性，下調(diào)SGK-1表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[14]。本研究結(jié)果顯示，UUO造模各組大鼠小管間質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)纖維化明顯，血清醛固酮含量顯著升高，SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，UP組表達(dá)高于UUO組，說(shuō)明妊娠誘導(dǎo)醛固酮活化，通過(guò)SGK-1/NF-κB 信號(hào)通路引起炎性損傷，加重慢性腎病大鼠細(xì)胞增殖及纖維化。

慢性腎病合并妊娠屬于本虛標(biāo)實(shí)之證，以腎脾虧虛為本，濁毒內(nèi)蘊(yùn)為標(biāo)。慢性腎臟病，素體本虛，孕后血聚養(yǎng)胎，胎兒奪精傷母，脾腎虧虛更甚，脾虛

失于運(yùn)化傳輸，腎虛不能氣化開闔，三焦決瀆失司，水濕內(nèi)停，釀生濁毒。虛則補(bǔ)之，實(shí)則瀉之，以益腎健脾瀉濁為法。益腎健脾瀉濁中藥由黃芪、當(dāng)歸、山藥、山茱萸、土茯苓、澤瀉、白芍、懷牛膝組成。補(bǔ)益氣血，扶助正氣；健脾益腎，固澀斂陰；利水除濕，瀉濁解毒。少佐懷牛膝，補(bǔ)益肝腎，活血通經(jīng)，且補(bǔ)氣而不瘀滯，活血而不傷正。諸藥相伍，補(bǔ)中寓瀉，標(biāo)本兼顧。現(xiàn)代研究表明，當(dāng)歸的主要成分阿魏酸與黃芪組分黃芪甲苷可改善造血功能障礙，提高機(jī)體免疫力[15]。黃芪、當(dāng)歸配伍，可通過(guò)減少尿蛋白，降低系膜細(xì)胞的增殖分化，緩解腎小管間質(zhì)的損傷，保護(hù)足細(xì)胞裂孔膜結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而減少繼發(fā)性腎臟損害[16]；山藥微粉可在一定程度上提高抗氧化能力[17]。白芍主要成分白芍總苷對(duì)減少炎癥介質(zhì)和炎性因子的分泌有一定作用，可有效保護(hù)腎臟功能[18]。

本研究結(jié)果表明，益腎健脾瀉濁中藥通過(guò)抑制醛固酮活化，下調(diào)SGK-1/NF-κB表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，減輕腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制，為臨床預(yù)防治療提供了理論依據(jù)。

致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室的各位老師及同學(xué)的幫助致以衷心的感謝！)