敬 岳，金 津，唐詩環(huán)，曹乃芹，廖 強(qiáng)，陳 燕，蔡 哲，張洪春△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 3. 中日友好醫(yī)院中醫(yī)肺病科,中日友好醫(yī)院呼吸中心；國家呼吸疾病臨床研究中心,北京 100029； 4. 中日友好醫(yī)院臨床研究所，北京 100029)

細(xì)顆粒物指環(huán)境空氣中空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑小于等于2.5 μm的顆粒物，具有粒徑小、面積大、活性強(qiáng)的特點(diǎn)，容易富集空氣中有毒重金屬、酸性氧化物、有機(jī)污染物以及細(xì)菌和病毒等。細(xì)顆粒物在空氣中停留時(shí)間長、輸送距離遠(yuǎn)且從呼吸道進(jìn)入人體，因此可直接引起呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生。補(bǔ)肺活血膠囊主要藥物組成有黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂，具有益氣活血、補(bǔ)肺固腎的作用。相關(guān)臨床及基礎(chǔ)研究提示，補(bǔ)肺活血膠囊可提高機(jī)體免疫力，緩解慢性支氣管炎及支氣管哮喘疾病患者的相關(guān)臨床癥狀，如咳嗽、咳痰、喘息、心悸、氣短等癥狀[1]，也可緩解慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者的相關(guān)臨床癥狀[2]。本研究將通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步觀察補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)細(xì)顆粒物所致小鼠肺損傷與修復(fù)過程的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR健康雌性小鼠70只，體質(zhì)量18～20 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004)。在溫度22～28 ℃，相對(duì)濕度50%～60%的清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、低劑量染毒組、低劑量染毒中藥組、中劑量染毒組、中劑量染毒中藥組、高劑量染毒組和高劑量染毒中藥組7組各10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)中藥

補(bǔ)肺活血膠囊組成有黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂，為已上市中成藥補(bǔ)肺活血膠囊，由雷允上藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局認(rèn)證通過批號(hào)(Z20030063)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.3.1 儀器 Anderson型顆粒物采樣器HBL-GUV(Thermo公司)；MK3酶標(biāo)儀(上海雷勃分析儀器有限公司)；自動(dòng)控溫離心機(jī)(日本 HITACHI公司)；T10 basic型自動(dòng)組織勻漿機(jī)(德國 IKA 公司)。

1.3.2 試劑 細(xì)顆粒物懸液、KGF抗體(小鼠，英國 Biorbyt公司)；免疫組化試劑盒(基因科技(上海)有限公司)；IL-4、IL-17 ELISA試劑盒(小鼠，美國R&D公司)。

2 方法

2.1 細(xì)顆粒物懸液與補(bǔ)肺活血中藥溶液制備

細(xì)顆粒物采集于2011年12月至2012年1月北京四環(huán)路中段保福寺橋和學(xué)院橋之間，用Anderson型顆粒物采樣器HBL-GUV(Thermo公司)采用聚四氟乙烯濾膜采樣細(xì)顆粒物，采樣器安置于距道路寬2 m，距地面高1.8～2.5 m處，連續(xù)2周, 將載有顆粒物的濾膜剪裁成1 cm×3cm 大小, 浸入去離子蒸餾水中, 超聲振蕩40 min×3次,洗脫顆粒物, 震蕩液經(jīng)6層紗布過濾, 濾液4 ℃、12000 r min 離心30 min, 收集下層懸液冷凍真空干燥、 稱重，低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ蒙睇}水配成所需濃度后超聲震蕩15 min,混勻并滅菌 4 ℃保存,臨用前振蕩使顆粒物充分混勻。相關(guān)研究表明，我國細(xì)顆粒物水溶性無機(jī)成分主要有NO-、SO2-、NH+4、Cl-、K+[4-5]。補(bǔ)肺活血中藥溶液制備：去除膠囊外殼將補(bǔ)肺活血膠囊內(nèi)藥粉按照一定比例與20 ℃蒸餾水充分溶解。

2.2 模型建立與干預(yù)方法

空白對(duì)照組：分別于模型建立第1、8、15和22天經(jīng)鼻腔滴入0.9%生理鹽水(20 μL/只)，其余時(shí)間正常飼養(yǎng)。細(xì)顆粒物低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組：分別于模型建立第1、8、15和22天經(jīng)鼻腔滴注細(xì)顆粒物懸液1.6 mg/ kg·bw，20 μL/只； 8 mg/ kg·bw，20 μL/只；40 mg/ kg·bw，20 μL/只；中藥干預(yù)組：低劑量染毒中藥組、中劑量染毒中藥組、高劑量染毒中藥組經(jīng)鼻腔滴注顆粒物劑量分別與低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組相同。

干預(yù)方法：空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)。細(xì)顆粒物低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組第1天至第22天，經(jīng)口灌服0.9%生理鹽水0.2 ml/只/d。低劑量染毒中藥組、中劑量染毒中藥組、高劑量染毒中藥組第1天至第22天，經(jīng)口灌服補(bǔ)肺活血中藥溶液(0.82 g/kg, 0.2 ml/只/d)，各個(gè)試驗(yàn)組均在最后1次染毒后48 h內(nèi)處死。

2.3 取材與指標(biāo)檢測

2.3.1 病理學(xué)分析 脫頸處死小鼠，開胸暴露胸腔，分離靠近肺門處的左肺上葉固定于10%甲醛溶液24 h，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察。

2.3.2 免疫組化 肺組織切片常規(guī)脫蠟后，按照免疫組化試劑盒具體操作步驟進(jìn)行檢測。采用美國Media Cybernetics公司生產(chǎn)的Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行分析，以累積光密度(Integrated Optical Density，IOD)反映蛋白表達(dá)總量。

2.3.3 ELISA檢測 取0.1 g右側(cè)肺葉組織放入1.5mlEP管中，制備成10%肺組織勻漿液，離心 4 ℃，12000 r/min，20 min取上清。按ELISA試劑盒提示的操作步驟說明進(jìn)行肺組織勻漿上清液中相關(guān)炎性介質(zhì)含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 中藥補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)細(xì)顆粒物模型小鼠肺組織病理損傷影響

圖1顯示，HE染色后觀察小鼠肺組織，空白對(duì)照組小鼠肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，肺泡間隔無明顯增寬，炎性細(xì)胞未見異常增多，肺泡腔及血管腔中未見明顯出血現(xiàn)象，肺組織內(nèi)氣道結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，氣道黏膜未見明顯脫落及損傷(A1)。細(xì)顆粒物模型小鼠肺泡腔明顯變小，肺泡間隔明顯增寬(圖中藍(lán)色箭頭指示)，肺泡間隔斷裂肺泡融合明顯，肺泡內(nèi)可見明顯滲出及紅細(xì)胞浸潤(圖中綠色箭頭)，肺間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤，肺組織內(nèi)氣管可見少量氣道黏膜上皮細(xì)胞脫落(圖中黑色箭頭指示)。且細(xì)顆粒物模型小鼠肺損傷程度可隨染毒劑量加大逐漸加重(A2、A4、A6)。經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后，細(xì)顆粒物模型小鼠肺泡腔較前明顯增大，肺泡間隔較染毒模型小鼠變薄，肺泡間隔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤程度減輕；肺泡內(nèi)及肺組織間隙紅細(xì)胞滲出明顯減少，氣管及終末細(xì)支氣管中氣道黏膜較為完整，未見明顯黏膜細(xì)胞脫落及氣道重塑(A3,A5,A7)。經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后，細(xì)顆粒物模型小鼠肺部炎性損傷及滲出明顯緩解(A1-A7)。

注：圖中藍(lán)色箭頭指示肺泡間隔明顯增寬，圖中綠色箭頭指示肺泡內(nèi)可見炎性滲出及紅細(xì)胞浸潤，黑色箭頭指示肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及肺組織內(nèi)氣道黏膜上皮細(xì)胞脫落圖1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織HE染色結(jié)果 (×200)

注：圖中黑色箭頭指示的褐色顆粒物為KGF表達(dá)位置。C1-C3各實(shí)驗(yàn)組中KGF蛋白表達(dá)總量與染毒模型組的比較:**P<0.01，*P<0.05。C4 中各實(shí)驗(yàn)組KGF蛋白表達(dá)總量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖2 各實(shí)驗(yàn)小組小鼠肺組織中KGF免疫組織化學(xué)染色及KGF蛋白總量表達(dá)比較

3.2 中藥補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)細(xì)顆粒物模型小鼠肺組織中 KGF表達(dá)及含量的影響

圖2顯示，角質(zhì)細(xì)胞生長因子(keratinocye growth factor KGF)免疫組織化學(xué)染色后可見KGF(棕色顆粒物)主要分布于肺泡壁內(nèi)側(cè)，肺泡與肺泡之間的組織間隙中有組織損傷的部位。空白對(duì)照組中，KGF主要表達(dá)于氣管壁內(nèi)側(cè)，柱狀上皮細(xì)胞(B1)。肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，肺泡及肺泡間組織中未見KGF大量表達(dá)。細(xì)顆粒物模型小鼠組中模型小鼠肺泡變小，肺泡間隔增寬，肺泡間組織中KGF表達(dá)明顯增多，隨染毒劑量的增加KGF在小鼠肺組織中的表達(dá)明顯增多 (B2,B4,B6)。經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后小鼠肺組織中肺泡腔明顯增大，肺泡間隔變窄，肺間質(zhì)中KGF的表達(dá)明顯降低(B3、B5、B7)。經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后小鼠肺組織結(jié)構(gòu)較前明顯好轉(zhuǎn)，KGF分泌明顯降低，小鼠肺組織修復(fù)過程緩解。通過半定量檢測計(jì)算KGF在肺組織中的含量可知經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后肺組織中KGF蛋白表達(dá)總量明顯低于染毒組(C1-C3)，但不同染毒劑量組模型小鼠肺組織中KGF蛋白表達(dá)總量未見明顯差異(C4)。

3.3 實(shí)驗(yàn)組中小鼠肺組織中IL-4、IL-17表達(dá)

表1顯示，與空白組比較細(xì)顆粒物染毒組中IL-4、IL-17在小鼠肺組織中的含量顯著增多(P)，且隨染毒劑量的增加IL-4、IL-17的表達(dá)進(jìn)一步升高；經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后，IL-4、IL-17在肺組織中的表達(dá)明顯下降(P)?？紤]經(jīng)補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后小鼠肺組織中的炎性介質(zhì)表達(dá)明顯下降。

4 討論

不同粒徑顆粒物可引發(fā)不同部位的損傷，顆粒物粒徑越小進(jìn)入組織的部位越深。因此，細(xì)顆粒物主要進(jìn)入支氣管并深入肺部，最終可導(dǎo)致支氣管哮喘急性發(fā)作，誘發(fā)支氣管炎癥及肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病[6]。本研究明確了經(jīng)鼻腔滴注細(xì)顆粒物懸液可以成功獲得模型小鼠肺部損傷的模型，細(xì)顆粒物模型小鼠肺損傷主要表現(xiàn)為小氣道、肺泡及肺間質(zhì)的炎性病變。IL-4是T細(xì)胞自身分泌的生長因子，會(huì)產(chǎn)生免疫紊亂進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[7-8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)肺活血膠囊可以降低細(xì)顆粒物模型小鼠肺組織中IL-4的分泌，考慮補(bǔ)肺活血膠囊可通過調(diào)節(jié)免疫機(jī)制影響炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。IL-17是多種炎癥反應(yīng)的起始因子，可促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞增殖，促進(jìn)炎癥募集[9]。補(bǔ)肺活血膠囊可有效抑制肺組織內(nèi)IL-17的分泌，從而延緩細(xì)顆粒物對(duì)組織造成的炎性損傷，緩解炎癥反應(yīng)過程。KGF是由γδT細(xì)胞的相關(guān)因子合成,可以刺激上皮細(xì)胞增殖、分化、遷移，以促進(jìn)黏膜修復(fù)完整性的維護(hù)。相關(guān)研究表明，KGF與肺纖維化有一定相關(guān)性[12]。補(bǔ)肺活血膠囊通過減少KGF在肺組織中的表達(dá)，減弱肺組織損傷修復(fù)過程，降低肺組織纖維樣變可能。呼吸系統(tǒng)疾病多是由于炎性、炎癥損傷、損傷后修復(fù)、纖維化的一系列病理反映過程，最終影響肺組織的整體結(jié)構(gòu)和功能。通過研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)肺活血膠囊可通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵炎癥因子的釋放，緩解細(xì)顆粒物所致的炎癥反應(yīng)，從而減弱損傷修復(fù)所致的肺組織結(jié)構(gòu)變化。

表1 各組小鼠肺組織勻漿上清液中IL-17、1 L-4含量(pg/ml)比較

注：與空白組比較:**P，*P<0.05

補(bǔ)肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂組成。黃芪性甘微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有益衛(wèi)固表、健脾補(bǔ)中之功；赤芍性苦微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散瘀止痛之效；補(bǔ)骨脂性溫，歸腎、脾經(jīng)，具有納氣平喘、補(bǔ)腎壯陽之功，故補(bǔ)肺活血膠囊具有補(bǔ)肺固腎、活血化瘀的功效。方中黃芪、補(bǔ)骨脂可調(diào)補(bǔ)肺腎，肺主氣，腎主攝納，故可使在體之氣固守于外，在內(nèi)之氣固攝于內(nèi)。相關(guān)臨床研究表明，補(bǔ)肺活血膠囊可明顯改善COPD患者的肺功能[1-3]，緩解矽肺患者肺部的炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。補(bǔ)肺活血膠囊中黃芪、補(bǔ)骨脂均可增強(qiáng)機(jī)體抵抗能力[11-12]，這與中醫(yī)正氣內(nèi)存邪不可干的理論相吻合，與建立小鼠模型的同時(shí)給予中藥干預(yù)和中醫(yī)治未病理論相符。中醫(yī)理論認(rèn)為空氣中細(xì)顆粒物即為外邪，結(jié)合顆粒物性質(zhì)空氣中顆粒物為陰邪、寒濕邪，為疫戾之氣。由于外邪入侵機(jī)體出現(xiàn)正邪相爭，正氣盛則邪氣難以入侵，邪氣盛則為病?？諝庵屑?xì)顆粒物首犯機(jī)體肺衛(wèi)，使氣血運(yùn)行失司，因此可見痰濁瘀血停滯體內(nèi)。扶助正氣是防止疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，補(bǔ)肺活血膠囊中黃芪、補(bǔ)骨脂均可補(bǔ)益正氣，赤芍則可活血通經(jīng)以防痰濁瘀血內(nèi)停。補(bǔ)肺活血膠囊在提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體正氣的同時(shí)，可以預(yù)防疾病的發(fā)生發(fā)展，以達(dá)到“治未病”的目的，該研究也可為防治顆粒物所致呼吸系統(tǒng)疾病提供新的研究思路和方向。