阮建文， 高麗娟， 蘇汝開， 王亞嬌， 陳朝陽

核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogue，NA]治療能夠有效抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復(fù)制，減少肝硬化、原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)和肝衰竭的發(fā)生。然而，NA治療停藥后常常出現(xiàn)病毒學(xué)反彈和臨床復(fù)發(fā)，甚至出現(xiàn)肝衰竭。NA長期治療20年以上，不僅費(fèi)用高，而且缺乏不良反應(yīng)相關(guān)數(shù)據(jù)，同時患者需要良好的依從性。由于臨床上經(jīng)NA治療后停藥過程比較常見，管理好這個臨床過程非常重要。因此，本研究對NA抗HBV治療停藥后發(fā)生慢性重度乙型肝炎患者的臨床特征和影響因素進(jìn)行分析，探討NA治療停藥后發(fā)生慢性重度乙型肝炎的臨床特征和獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1 對象與方法

1.1對象 收集2012年1月-2016年12月經(jīng)NA治療停藥后復(fù)發(fā)的慢性乙型肝炎患者41例，男性35例(85.37%)，女性6例(14.63%)，年齡(41.15±11.28)歲(23～68歲)。乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)陽性27例(65.85%)，陰性14例(34.15%)?？笻BV治療療程為(72±66)周(12～84周)。臨床分型：慢性輕度、中度及重度乙型肝炎分別為12例(29.27%)，8例(19.51%)及21例(51.22%)。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》和《病毒性肝炎防治方案(2000年版)》[1]。納入標(biāo)準(zhǔn)：抗HBV治療療程≥48周，停藥前獲得病毒學(xué)應(yīng)答和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除肝硬化、肝衰竭、酒精性肝病、藥物性肝損害、自身免疫性肝病患者，排除合并甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus, HDV)、戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)、人類免疫缺陷病毒感染者。

1.2方法 采集患者的性別，年齡，停藥復(fù)發(fā)后的血清肝功能、腎功能、HBV DNA、HBV標(biāo)志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)，肝臟B型超聲，以及NA治療用藥過程。根據(jù)復(fù)發(fā)的臨床分型分為慢性重度乙型肝炎組和非慢性重度乙型肝炎組。比較2組患者的臨床特征，并進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，篩選出抗HBV治療停藥后出現(xiàn)慢性重度乙型肝炎患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1.3檢測指標(biāo) 肝功能指標(biāo)分析采用生化試劑盒(廣東省標(biāo)佳生物集團(tuán))，儀器采用全自動生化儀(C16000，美國Abbott公司)；HBV血清學(xué)標(biāo)志物采用全自動化學(xué)發(fā)光測定儀及配套試劑(IS 1200，中國邁克生物股份有限公司)；HBV DNA載量采用HBV核酸測定試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)和實(shí)時熒光定量PCR儀(Roche LC480Ⅱ，瑞士羅氏公司)檢測。

2 結(jié) 果

2.1慢性重度乙型肝炎的臨床特征分析 慢性重度乙型肝炎組中，ALT值>600 U/L 14例，400～600 U/L 4例，<400 U/L 3例；而非慢性重度乙型肝炎組患者ALT值均<400 U/L。慢性重度乙型肝炎組中，總膽紅素(total bilirubin, TBil)≥5倍正常值上限(upper limit of normal，ULN)9例，而非慢性重度乙型肝炎組患者的TBil均<5倍ULN。

慢性重度乙型肝炎患者的血清ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)及TBil中位數(shù)均較非慢性重度乙型肝炎患者顯著升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。HBV DNA水平較非慢性重度乙型肝炎患者高，而血清白蛋白(albumin，Alb)水平低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組的性別、年齡及HBeAg狀態(tài)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表12組患者的臨床特征分析

Tab1Clinical characteristics of patients were analysed in two groups

臨床特征慢性重度乙型肝炎組非慢性重度乙型肝炎組n2120性別(男性)17(80.95)18(90.00)年齡/歲42.62±9.5841.65±13.06HBeAg15(71.43)12(60.00)cALT/(U·L-1) 666.0(296.0)☆☆94(112.0)cAST/(U·L-1) 500.0(264.0)☆☆63.0(63.25)ρAlb/(g·L-1)38.01±3.5740.24±3.69cTBil/(mol·L-1) 49.0(98.5)☆☆13.0(9.75)HBV DNA(log10拷貝/mL) 7.339±1.164☆6.560±1.194

表中數(shù)據(jù)性別(男性)、HBeAg為n(%). ALT：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；TBil：總膽紅素；Alb：白蛋白. 與非慢性重度乙型肝炎組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

2.2NA治療停藥后發(fā)生慢性重度乙型肝炎的分層分析 比較2組患者的性別、年齡、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、HBeAg、治療藥物種類，差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBV DNA≥7.0 log10拷貝/mL、抗病毒療程≥96周患者慢性重度乙型肝炎發(fā)生率均較非慢性重度乙型肝炎患者高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表22組患者分層分析結(jié)果

Tab2Clinical characteristics of patients were analysed by stratified sampling in two groups

影響因素n慢性重度乙型肝炎組非慢性重度乙型肝炎組性別 男性3517(48.57)18(51.43) 女性64(66.7)2(33.3)年齡/歲 <452411(45.83)13(54.17) ≥451710(58.82)7(41.82)HBsAg/(IU·mL-1) ≤25021(50.00)1(50.00) >2503920(51.28)19(48.72)HBeAg 陽性2715(55.56)12(44.44) 陰性146(42.86)8(57.14)HBV DNA☆/(log10拷貝/mL) ≥7.01913(68.42)6(31.58) <7.0228(36.36)14(63.64)治療藥物 LAM/LDT155(33.33)10(66.67) ADV159(60.00)6(40.00) ETV117(63.64)4(36.36)抗病毒療程☆/周 <96249(37.50)15(62.50) ≥961712(70.59)5(29.41)

LAM：拉米夫定； LDT：替比夫定； ADV：阿德福韋酯； ETV：恩替卡韋. 與非慢性重度乙型肝炎組比較，☆：P<0.05.

2.3NA治療停藥后發(fā)生慢性重度乙型肝炎患者的危險(xiǎn)因素 將性別、年齡、HBV DNA、抗HBV治療療程、HBsAg水平、HBeAg狀態(tài)、NA治療藥物種類納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，HBV DNA水平、抗HBV治療療程2個因素對慢性重度乙型肝炎的發(fā)生存在重要的影響(表3)。

表3NA治療停藥后發(fā)生慢性重度乙型肝炎的多因素分析

Tab3A multivariate analysis on HBV-associated chronic severe hepatitis B induced by discontinuation of nucleoside analogues

指 標(biāo)回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤χ2PORHBV DNA1.5030.7254.2940.0384.493抗病毒療程1.5560.7404.4240.0354.738常數(shù)-5.8282.2846.5120.0110.003

3 討 論

抗HBV治療可長期抑制病毒的復(fù)制，延緩和減少肝衰竭、肝硬化、HCC及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[2-3]。HBsAg清除是治療的理想終點(diǎn)，但當(dāng)前僅有極少數(shù)患者能達(dá)此終點(diǎn)[3]。NA治療方便、不良反應(yīng)小，目前在臨床上廣泛使用。文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)過8年替諾福韋酯治療，HBeAg陽性患者的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為31%，HBsAg消失率為13%，HBeAg陰性患者的HBsAg消失率為1.1%[1]。NA治療達(dá)到理想終點(diǎn)和滿意終點(diǎn)較為困難，治療后停藥在臨床上較為常見。臨床復(fù)發(fā)可表現(xiàn)為各種臨床類型慢性病毒性肝炎，甚至肝衰竭。NA治療停藥后的肝衰竭既往已有廣泛報(bào)道[4-5]，而有關(guān)停藥后的慢性重度乙型肝炎的研究較少。肝衰竭患者死亡率高，而慢性重度乙型肝炎患者的肝細(xì)胞損傷重，可以進(jìn)展為肝衰竭。

本研究中，慢性重度乙型肝炎組患者的ALT，AST，TBil及HBV DNA均較非慢性重度乙型肝炎組明顯升高，尤其ALT及AST的水平升高至10倍ULN以上，表現(xiàn)為急性肝損傷的臨床過程。NA治療停藥后的慢性重度乙型肝炎屬于NA治療停藥后HBV激活的范疇，臨床過程類似于慢性乙型肝炎急性發(fā)作[6]。本研究觀察病例符合慢性乙型肝炎急性發(fā)作的特點(diǎn)與過程，經(jīng)過治療肝功能可全部恢復(fù)正常[7]。少數(shù)病例進(jìn)展為肝衰竭，本研究予以排除。NA治療停藥后，HBV激活的患者如不及時重新抗病毒治療，有進(jìn)展為肝衰竭的風(fēng)險(xiǎn)[6]。

既往研究證實(shí)，經(jīng)NA抗病毒治療達(dá)到停藥標(biāo)準(zhǔn)的患者出現(xiàn)停藥后復(fù)發(fā)相關(guān)影響因素有年齡、基線HBV DNA水平、血清HBsAg水平及抗病毒治療療程[8-11]。抗病毒藥物的種類可能是停藥復(fù)發(fā)的影響因素[8]。需要指出的是，HBsAg消失是治療的理想終點(diǎn)，但許多研究表明，停藥時HBsAg的水平<200 IU/mL可以預(yù)測停藥后持續(xù)應(yīng)答[12-14]。從而推斷，停藥后出現(xiàn)慢性重度乙型肝炎的危險(xiǎn)因素可能為年齡、性別、HBsAg水平、HBeAg抗原狀態(tài)、HBV DNA載量、藥物治療時間及NA種類。進(jìn)一步分析，篩選出HBV DNA載量、藥物治療療程是停藥后發(fā)生慢性重度乙型肝炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

經(jīng)NA治療的慢性乙型肝炎患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)反彈較常見，部分患者可出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)。停藥后病毒復(fù)制增加是影響臨床復(fù)發(fā)的主要危險(xiǎn)因素[15]。停用抗HBV藥物后，病毒復(fù)制顯著增加，大量肝細(xì)胞被感染，特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞聚集在肝臟，對受感染肝細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫損傷，導(dǎo)致大量肝細(xì)胞壞死，造成嚴(yán)重肝炎[16]。在急性乙型肝炎過程中，首先HBV大量復(fù)制形成病毒血癥，然后特異性T細(xì)胞活化，繼而出現(xiàn)肝細(xì)胞損害和肝功能異常，在出現(xiàn)ALT峰值前，病毒的復(fù)制已經(jīng)處于抑制狀態(tài)[17-18]。人感染HBV后，特異性CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、細(xì)胞因子(IFN-γ，TNF-α等)通過細(xì)胞溶解或非溶解機(jī)制清除感染的肝細(xì)胞，這個過程中特異性CD8+T細(xì)胞在清除肝細(xì)胞內(nèi)的HBV起主導(dǎo)作用[19-21]。

本研究篩選出藥物治療療程是停藥后的慢性重度乙型肝炎發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有關(guān)停用NA誘發(fā)HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者的抗病毒治療療程，劉曉燕等報(bào)道為36～48月[4]；胡高飛等報(bào)道，≤12月占37.96%，12～24月占21.17%，>24月占40.88%[5]。經(jīng)NA治療抑制HBV復(fù)制過程較緩慢，治療療效需要較長時間才能體現(xiàn)[22]，本研究納入病例的抗病毒治療療程>48周。本研究顯示，抗病毒療程>96周是停藥后的慢性重度乙型肝炎發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。當(dāng)然，上述2個研究的臨床類型為肝衰竭，而本研究為慢性重度乙型肝炎。筆者認(rèn)為這兩個臨床過程相似，肝衰竭可能為慢性重度乙型肝炎病情發(fā)展的結(jié)果。需要指出的是，本研究為單個中心研究的結(jié)果，抗病毒治療療程與停藥后慢性重度乙型肝炎發(fā)生關(guān)系需更多研究證實(shí)。

HBV感染者長期暴露于HBV相關(guān)抗原，導(dǎo)致特異性CD8+T淋巴細(xì)胞頻率及應(yīng)答水平降低，表現(xiàn)為特異性CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答缺失或減弱并喪失其增殖能力，而特異性CD8+T淋巴細(xì)胞耗竭是HBV感染后慢性化的基礎(chǔ)[21,23]。通過NA抗病毒治療，可以使HBV特異性CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的頻數(shù)增加且功能增強(qiáng)[24-26]，IFN-γ，TNF-α及IL-10等細(xì)胞因子水平增加和T淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-1下降[27]。

NA治療停藥后的過程研究集中于停藥后獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的預(yù)測因素篩選，停藥后的臨床復(fù)發(fā)與肝衰竭相關(guān)研究相對較少，尤其在歐美國家。本研究的探討主題為停用NA后出現(xiàn)嚴(yán)重肝功能損害的臨床過程及危險(xiǎn)因素，所有患者無肝衰竭發(fā)生。這個臨床過程若未進(jìn)行及時有效的干預(yù)，易進(jìn)展為肝衰竭，需臨床醫(yī)師加以關(guān)注，并進(jìn)一步研究。