程志豪， 頓耀艷， 劉 潔， 李玉婷， 郭煜暉， 何毓敏， 袁 丁， 張長城?

（1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002；2.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院，湖北宜昌443002）

隨著老年人口占總?cè)丝诒壤絹碓酱?，其健康問題逐漸受到人們關(guān)注。腸道在機(jī)體內(nèi)的主要功能是吸收營養(yǎng)物質(zhì)、阻擋細(xì)菌等有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體，增齡過程中腸道炎癥反應(yīng)可使其黏膜屏障功能受損，腸道內(nèi)細(xì)菌容易移位進(jìn)入機(jī)體多個系統(tǒng)，從而導(dǎo)致機(jī)體長期處于慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，引發(fā)腸內(nèi)外多種疾?。?］。

在衰老過程中，老年人隨著年齡增加容易出現(xiàn)營養(yǎng)不良、便秘、大小便失禁，而衰老引起的腸道免疫系統(tǒng) （如胃腸道黏膜層受損）可能增加年齡相關(guān)感染性疾病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度［2］。腸上皮細(xì)胞在腸道黏膜屏障中具有重要作用，可識別細(xì)菌、病毒等有害物質(zhì)，并產(chǎn)生免疫反應(yīng)；TLR4在固有免疫系統(tǒng)中有重要作用，可識別革蘭氏陰性菌脂多糖，介導(dǎo)MyD88途徑和非依賴性MyD88途徑［3］。研究表明，降低腸黏膜TLR4表達(dá)時，機(jī)體免疫球蛋白A（IgA）分泌減少，腸黏膜免疫屏障受損，抗細(xì)菌侵襲能力減弱，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌易位［4］；課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠小腸上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞減少，腸黏膜免疫能力下降［5］，并且在衰老過程中大鼠結(jié)腸屏障功能減弱，炎癥因子IL-1β、TNF-α等表達(dá)增加［6］，但衰老大鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)是否與TLR4信號通路介導(dǎo)的免疫功能減弱相關(guān)尚不明確。

竹節(jié)參為五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japoni-cus C.A.Mey的干燥根莖，是一種常見中草藥，皂苷類為其主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。課題組前期研究顯示，竹節(jié)參總皂苷可降低非甾體抗炎藥引起的腸損傷［7］，改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠免疫功能降低［8］；本實驗主要研究該成分對衰老大鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)的改善作用。

1 材料

1.1 動物 48只SPF級SD雄性大鼠，購自三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2011-0061。

1.2 試藥 竹節(jié)參采自湖北省恩施州椿木營竹節(jié)參種植基地，經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院鄒坤教授鑒定為五加科植物竹節(jié)參Panax japoni-cus C.A.Mey的干燥根莖，將干燥藥材制成粉，60%乙醇加熱回流提取，合并濾液，濃縮干燥后得到總皂苷提取物，采用香草醛-高氯酸比色法 （以人參皂苷Re為對照品）測得其含有量為67.66%。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （日本 TaKaRa公司）；β-actin、IL-6、IL-23引物（生工生物工程有限公司），序列見表 1；一抗 TLR4、TRAF6（美國Santa Cruz公司）。

表1 引物序列

1.3 儀器 EG1150H石蠟包埋機(jī)、TP1020脫水機(jī)、Ultracutr超薄切片機(jī) （德國Leica公司）；CX41光學(xué)倒置顯微鏡 （日本Olympus公司）；VeritiTM96-Well Thermal Cycler梯度PCR儀 （德國Applied Biosysterms公司）；1-15 K離心機(jī) （美國Sigma公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為青年組 （6月齡）、自然衰老組 （24月齡）［6］及竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組，每組12只；取36只給予正常飼料的18月齡大鼠，隨機(jī)分為自然衰老組及竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組，其中自然衰老組給予正常飼料至24月齡，竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組通過飼料連續(xù)給予10、30 mg／kg竹節(jié)參總皂苷6個月，每天1次；取12只6月齡大鼠作為青年組。24月齡時給藥結(jié)束，稱量并記錄每只大鼠體質(zhì)量，10%烏拉坦麻醉，固定在鼠板上，剪開腹部取血后分離腸道組織，取新鮮結(jié)腸組織2 cm左右，立即放入包埋盒并投入4%多聚甲醛，剩下結(jié)腸組織剪開，生理鹽水清洗糞便后立即置于－80℃冰箱中保存。

2.2 阿利新藍(lán)、高碘酸-Schiff試劑 （PAS）染色 4%多聚甲醛固定24 h后，更換75%酒精，常規(guī)脫水、包埋，連續(xù)切片 （4 μm），經(jīng)冷水、45℃熱水?dāng)偲箴じ接谳d玻片上，60℃下烘烤4 h。阿利新藍(lán)染色：常規(guī)脫蠟后用蒸餾水沖洗，然后甩干液體，立即滴加阿利新藍(lán)染液，孵育5 min，蒸餾水沖洗干凈，甩干后每個組織上滴加1滴核固紅染液，室溫下孵育2 min，流水沖洗后吹干封片；PAS染色：常規(guī)脫蠟后用蒸餾水沖洗，然后甩干每張玻片上的蒸餾水，滴加高碘酸染液孵育10 min，流水沖洗后，甩干組織上水分，滴加1滴雪夫試劑，避光孵育10 min，流水沖洗，滴加蘇木素染液1 min，流水沖洗，吹干封片。顯微鏡取圖，每組隨機(jī)取5只大鼠，每只結(jié)腸各取3張不連續(xù)切片，阿利新藍(lán)、PAS染色計算結(jié)腸組織10個隱窩杯狀細(xì)胞數(shù)量，計算平均值。

2.3 免疫組織化學(xué)法 結(jié)腸組織脫水包埋后石蠟切片，每張組織切片厚度4 μm，經(jīng)冷水、45℃熱水?dāng)偲?0℃下烘烤4 h。常規(guī)脫蠟后蒸餾水浸泡3 min，配制檸檬酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)6 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min，甩干后滴加3%H2O2，37℃下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，甩干水分后每個組織滴加1滴5%BSA，室溫下封閉1 h，PBS沖洗干凈后置于一抗?jié)窈兄校?℃下孵育過夜，PBS沖洗，二抗室溫下孵育1 h，PBS沖洗，甩干后臨時用蒸餾水配制DAB顯色，顯色完成后流水沖洗，甩干后滴加蘇木素40 s，鹽酸酒精分化1 s，流水沖洗后脫水，風(fēng)干封片。

2.4 RT-PCR法 稱取適量新鮮結(jié)腸組織，提取組織中總RNA，并用DEPC水溶解，核酸測定儀測定RNA濃度及D（λ）260nm／D（λ）280nm， 重復(fù) 1 次， 2 次測得的結(jié)果均在 1.8～2.2范圍內(nèi)，而且濃度相差不得超過20 μg／mL。逆轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μL（10.5 μL DEPC水，12.5 μL PCR Master mix， IL-6、 XBP1 引物正反向各0.5 μL， 1 μL cDNA 模板）； 擴(kuò)增條件為 94 ℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，GOTO2 30次，72℃5 min，4℃，以β-actin為內(nèi)參。配制2%瓊脂糖凝膠，將擴(kuò)增產(chǎn)物加到配制好的凝膠孔中電泳30 min，凝膠成像儀拍照保存內(nèi)參和目的條帶，計算光密度，通過Image J軟件計算IL-6、XBP1與β-actin光密度的比值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果通過SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，RT-PCR、免疫組織化學(xué)法結(jié)果通過Image J軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以 （±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 竹節(jié)參總皂苷對大鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響 圖1顯示，與青年組比較，自然衰老組杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組其數(shù)量顯著增加 （P＜0.05）。

圖1 竹節(jié)參總皂苷對杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響 （阿利新藍(lán)、PAS染色，×200）（n＝6）

3.2 竹節(jié)參總皂苷對大鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-23 mRNA表達(dá)的影響 圖2顯示，與青年組比較，自然衰老組IL-6、IL-23 mRNA表達(dá)顯著升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組兩者mRNA表達(dá)顯著降低 （P＜0.05， P＜0.01）。

圖2 竹節(jié)參總皂苷對IL-6、IL-23 mRNA表達(dá)的影響 （n＝6）

3.3 竹節(jié)參總皂苷對大鼠結(jié)腸組織STAT3蛋白表達(dá)的影響 圖3顯示，與青年組比較，自然衰老組STAT3蛋白表達(dá)顯著升高 （P＜0.01）；與自然衰老組相比，竹節(jié)參總皂苷組其蛋白表達(dá)顯著降低 （P＜0.01）。

圖3 竹節(jié)參總皂苷對STAT3蛋白表達(dá)的影響 （n＝6）

3.4 竹節(jié)參總皂苷對大鼠結(jié)腸組織 TLR4、MYD88、TRAF6蛋白表達(dá)的影響 圖4顯示，與青年組比較，自然衰老組 TLR4、MYD88、TRAF6蛋白表達(dá)顯著降低 （P＜0.01）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組三者蛋白表達(dá)顯著升高 （P＜0.05， P＜0.01）。

4 討論

在衰老過程中，機(jī)體腸道屏障功能和免疫功能逐漸減弱，使得機(jī)體容易長期處于慢性炎癥狀態(tài)，引發(fā)許多炎癥和衰老相關(guān)疾病，腸道黏液屏障的重要成分黏蛋白主要由杯狀細(xì)胞分泌，其減少可使腸道黏液屏障受損，從而導(dǎo)致腸道有害物質(zhì)和微生物進(jìn)入機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸道組織中杯狀細(xì)胞數(shù)減少［9］，而Gersemann等［9］報道靈長類動物腸道黏膜屏障功能發(fā)生障礙，而且炎癥因子IL-1β、IL-6等表達(dá)增加，其中IL-6是一種來源于Th2細(xì)胞的炎癥因子，可與其受體結(jié)合活化STAT3，后者是腸道炎癥發(fā)生的重要信號分子，阻斷其可抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎［10］；IL-23是一種重要的促炎因子，能作用于Th17細(xì)胞，使其分泌IL-17而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，在小兒炎癥性腸病中表達(dá)增加［11］。本實驗發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后大鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)顯著增加，結(jié)腸組織IL-6、IL-23 mRNA及STAT3蛋白表達(dá)顯著降低，表明它可增強(qiáng)腸道黏液屏障，減輕炎癥反應(yīng)。

隨著機(jī)體衰老，免疫系統(tǒng)功能逐漸減退，機(jī)體對各種內(nèi)外刺激的識別能力和處理能力也有所減弱。腸道黏膜免疫系統(tǒng)的主要作用是防止細(xì)菌、病毒等有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體，而在老年人中黏膜免疫能力下降，導(dǎo)致胃腸道細(xì)菌和病毒感染更常見［12］。腸道上皮細(xì)胞是腸屏障的重要部分，可識別微生物等外來物質(zhì)，并對其刺激作出相應(yīng)反應(yīng)，從而加強(qiáng)腸屏障功能，還可參與多種免疫反應(yīng)，如果腸上皮細(xì)胞免疫功能降低，則機(jī)體更容易受到微生物感染，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，而腸道上皮細(xì)胞對大多數(shù)有害菌 （如革蘭氏陰性菌）的識別主要通過TLR4信號通路。研究表明，TLR4／MYD88介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可保護(hù)腸道免受沙門氏菌感染［13］，其中Toll樣受體 （TLR）是腸道固有免疫細(xì)胞上一種重要的模式識別分子受體 （PRRs）［14］，TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動物TLR，主要通過識別細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分脂多糖 （LPS）來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其主要過程是LPS與其結(jié)合蛋白結(jié)合后轉(zhuǎn)運(yùn)給CD14，再轉(zhuǎn)運(yùn)給MD2／TLR4復(fù)合物，從而激活髓樣分化因子88（MYD88）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）表達(dá)，研究表明，衰老小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)降低，而血漿炎癥因子的表達(dá)明顯增高［15］。腸道中多種免疫細(xì)胞均可能參與炎癥反應(yīng)，如輔助性T淋巴細(xì)胞17（Th17）可分泌IL-17，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)IL-6、TNF-α產(chǎn)生［16］，提示衰老小鼠炎癥可能不是來源于腸上皮免疫細(xì)胞，而是其他免疫細(xì)胞。本實驗發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后大鼠結(jié)腸組織TLR4、MYD88、TRAF6蛋白表達(dá)顯著增加，表明它可改善TLR4信號通路介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)功能降低。

綜上所述，竹節(jié)參總皂苷可增強(qiáng)衰老大鼠腸道免疫功能，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與改善TLR4信號通路介導(dǎo)的腸道免疫功能降低有關(guān)。