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(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.朝陽本色有機(jī)食品有限公司,遼寧朝陽 122312;3.遼寧新大地實(shí)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司,遼寧沈陽 110168)

紅樹莓(RubusideausL.)屬薔薇科懸鉤子屬聚合類漿果,又稱馬林、山莓和覆盆子等,果實(shí)營養(yǎng)豐富,有著“黃金漿果”美譽(yù)[1-2]。紅樹莓皮薄多汁,極不易貯運(yùn),多被加工為果汁和果酒等,而副產(chǎn)物紅樹莓籽多被丟棄,造成資源浪費(fèi)。紅樹莓籽富含黃酮類化合物[3],具有抗腫瘤、抗菌、降血脂和降血壓等功效[4-6]。黃酮類化合物溶解性低,穩(wěn)定性差[7],易受pH、溫度、光照及添加劑影響被氧化分解,限制了其應(yīng)用范圍。

微膠囊技術(shù)是采用成膜材料將分散均勻的目的物包埋成微小粒子的一種微型包裝技術(shù),能夠減少外界因素對(duì)芯材影響[8],提高穩(wěn)定性。復(fù)凝聚法制備微膠囊是將兩種帶相反電荷膠體混合,聚電解質(zhì)復(fù)合物沉積在芯材周圍形成微膠囊[9],此法條件溫和,操作簡便,控釋性好[10]。明膠是一種帶正電荷的蛋白質(zhì),具有高相容性、乳化性及凝膠性[11],羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose,CMC)屬一種纖維素衍生物,具有良好的溶解性、抗拮性和分散性[12-13],兩者復(fù)合可形成凝聚物,用作微膠囊壁材。近年來,精油、維生素及色素等微膠囊研究報(bào)道較多[10,13],而黃酮類化合物相關(guān)研究主要集中于提取、純化和藥理活性等方面[3-4],以明膠和CMC為壁材通過凝聚反應(yīng)包埋紅樹莓籽黃酮微膠囊尚未見報(bào)道。

因此,本試驗(yàn)以紅樹莓籽黃酮為芯材,明膠和CMC為壁材,通過響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)凝聚制備紅樹莓籽黃酮微膠囊工藝,旨在提高黃酮穩(wěn)定性,擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。其次,將紅樹莓籽黃酮及其微膠囊進(jìn)行水分含量、休止角、溶解度、粒徑、差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)及體外胃腸消化分析,探究黃酮微膠囊理化特性及緩釋效果,為其在食品領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓籽 大連中超食品有限公司;明膠、單干酯、CMC 食品級(jí),廣州市濤升化工有限公司;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase,TG酶) 食品級(jí),上海康達(dá)食品工程有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶 分析純,Sigma公司;豬膽鹽 生化試劑,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、石油醚、甲醇 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

UV-2700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津有限公司;Nano-ZS90激光粒度儀 英國馬爾文公司;PYRIS DIAMOND TG/TA熱分析儀 美國PE公司;DSCQ2000差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司;GT-100高通量組織研磨儀 北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;ALPH1-2LDPLUS真空冷凍干燥機(jī) 北京奧創(chuàng)興業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅樹莓籽黃酮提取 水分含量為3.8%紅樹莓籽在1200 r/min下研磨1 min,過60目篩,采用石油醚在料液比1∶10 g/mL、溫度40 ℃下脫脂4 h,混合物抽濾分離,自然風(fēng)干成粉;紅樹莓籽脫脂粉在料液比1∶30 g/mL、乙醇濃度80%、提取溫度50 ℃下,提取2 h,抽濾,取濾液在55 ℃下旋蒸除醇,冷凍干燥成粉備用[14]。

1.2.2 紅樹莓籽黃酮微膠囊制備 分別配制一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)明膠與CMC;取一定量紅樹莓籽黃酮于無水乙醇溶解后與明膠混勻,加入2%壁材總質(zhì)量的單干酯,3000 r/min下乳化1 min,于一定溫度水浴中緩慢加入CMC混勻,10%醋酸溶液調(diào)pH至4.5,300 r/min攪拌反應(yīng)30 min;10% NaOH溶液調(diào)pH至6.5,10 ℃冰浴下加入TG酶固化1 h,靜置、沉降、洗滌抽濾、真空冷凍干燥、粉碎得到紅樹莓籽黃酮微膠囊樣品[15]。

1.2.3 紅樹莓籽黃酮微膠囊制備單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 壁材配比選擇 在壁材濃度1.5%、芯壁比1∶5 (w∶w)、反應(yīng)溫度40 ℃條件下,考察壁材配比(明膠∶CMC)分別為5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1 (w∶w)對(duì)微膠囊包埋效果影響,根據(jù)包埋率選取最佳壁材配比。

1.2.3.2 壁材濃度選擇 在壁材配比(明膠∶CMC)9∶1、芯壁比1∶5、反應(yīng)溫度40 ℃條件下,考察壁材濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%對(duì)微膠囊包埋效果影響,根據(jù)包埋率選取最佳壁材濃度。

1.2.3.3 芯壁比選擇 在壁材配比(明膠∶CMC)9∶1、壁材濃度1.5%、反應(yīng)溫度40 ℃條件下,考察芯壁比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 (w∶w)對(duì)微膠囊包埋效果影響,根據(jù)包埋率選取最佳芯壁比。

1.2.3.4 反應(yīng)溫度選擇 在壁材配比(明膠∶CMC)9∶1、壁材濃度1.5%、芯壁比1∶5條件下,考察反應(yīng)溫度分別為30、35、40、45、50 ℃對(duì)微膠囊包埋效果影響,根據(jù)包埋率選取最佳反應(yīng)溫度。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取對(duì)包埋效果影響較大的芯壁比(A)、壁材濃度(B)、反應(yīng)溫度(C)為因素,包埋率為響應(yīng)值,采用Design-Expert 8.0.6軟件Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化微膠囊制備工藝,因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 微膠囊包埋率測定 稱取25 mg紅樹莓籽黃酮微膠囊于無水乙醇中溶解,反復(fù)振蕩洗滌,過濾,濾液定容至25 mL,濾液中黃酮含量即為微膠囊表面黃酮含量;稱取25 mg紅樹莓籽黃酮微膠囊于60%乙醇中溶解,反復(fù)振蕩洗滌過濾,濾液定容至25 mL,濾液中黃酮含量即為微膠囊中黃酮含量[16]。微膠囊包埋率計(jì)算見公式(1)。

式(1)

1.2.6 黃酮微膠囊理化特性測定 水分含量測定參照GB5009.3-2016[17],休止角測定參照劉安然[18]方法,溶解度測定參照夏慧亭[19]方法,粒徑測定參照廖霞等[20]方法,DSC測試參照劉成祥等[21]方法。

1.2.7 紅樹莓籽黃酮微膠囊體外胃腸模擬消化試驗(yàn)

1.2.7.1 體外模擬胃消化 分別稱取0.25 g紅樹莓籽黃酮和0.50 g紅樹莓籽黃酮微膠囊,于10 mL生理鹽水混勻后,加入4 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液和4 mL的8 mg/mL胃蛋白酶溶液,調(diào)pH至2.0,同時(shí),以生理鹽水替代酶液作空白對(duì)照,于37 ℃恒溫水浴振蕩器中分別消化0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,取樣后在4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min,取上清液測定紅樹莓籽黃酮濃度[22-23]。

1.2.7.2 體外模擬腸消化 分別向體外胃消化2.5 h的黃酮及黃酮微膠囊胃消化液中加入1 mol/L的NaHCO3調(diào)pH至7.0,加入6 mL腸消化液(0.3 g胰酶和1.9 g豬膽鹽溶于60 mL pH為7.0的0.1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液),同時(shí)做腸液空白對(duì)照,于37 ℃恒溫水浴振蕩器中分別消化0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,取樣后在4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min,取上清液測定紅樹莓籽黃酮濃度[24]。

1.2.8 黃酮含量測定 采用硝酸鋁法[3],在波長510 nm處繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.75x+0.047,R2=0.9996,線性關(guān)系良好,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅樹莓籽黃酮濃度。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Word 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖,SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析,水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹莓籽黃酮微膠囊制備單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 壁材配比對(duì)黃酮微膠囊化的影響 壁材配比對(duì)黃酮微膠囊包埋效果影響如圖1所示,當(dāng)明膠和CMC質(zhì)量比在5∶1～9∶1內(nèi),包埋率顯著升高(p<0.05),是因體系正負(fù)電荷差距逐漸縮小,凝聚效果逐漸增強(qiáng);當(dāng)壁材配比為9∶1時(shí),包埋率最高,是因體系中正負(fù)電荷數(shù)較接近,復(fù)凝聚狀態(tài)較佳[9];壁材配比在9∶1～13∶1時(shí),包埋率顯著降低(p<0.05),是因明膠比例過多,凝聚物流動(dòng)性變差,易形成空囊。因此,選取最佳壁材配比(明膠∶CMC)為9∶1。

圖1 壁材配比對(duì)微膠囊包埋率影響Fig.1 The effect of different wall ratios on the embedding rate of microcapsule注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，圖2～圖4同。

2.1.2 壁材濃度對(duì)黃酮微膠囊化的影響 壁材濃度對(duì)微膠囊包埋效果影響如圖2所示,壁材濃度在0.5%～1.0%內(nèi),包埋率顯著升高(p<0.05),是因隨壁材濃度增加,芯材與壁材接觸率增大,黃酮包埋效果逐漸增強(qiáng);當(dāng)壁材濃度為1.0%時(shí),微膠囊包埋率達(dá)到最高;壁材濃度在0.5%～2.5%內(nèi),包埋率顯著降低(p<0.05),是因壁材濃度過高,體系黏度過大,微膠囊相互碰撞粘連，導(dǎo)致芯材泄露[16]。因此,選取最佳壁材濃度為1.0%。

圖2 壁材濃度對(duì)微膠囊包埋率影響Fig.2 The effect of different wall material concentrations on the embedding rate of microcapsule

2.1.3 芯壁比對(duì)黃酮微膠囊化的影響 芯壁比對(duì)微膠囊包埋效果影響如圖3所示,當(dāng)芯壁比為1∶3時(shí),包埋率較低,是因芯材濃度過高,囊壁較薄,易出現(xiàn)裂縫,引起芯材滲透;芯壁比在1∶3～1∶4時(shí),包埋率顯著升高(p<0.05),是因隨壁材濃度升高,囊壁厚度增加,芯材損失逐漸減少;當(dāng)芯壁比1∶4～1∶7時(shí),包埋率顯著下降(p<0.05),是因芯材濃度過低,微囊形狀不穩(wěn)定,易聚集黏連[20],包埋率降低。因此,選取最佳芯壁比為1∶4。

圖3 芯壁比對(duì)微膠囊包埋率影響Fig.3 The effect of core/wall material ratios on the embedding rate of microcapsules

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)黃酮微膠囊化的影響 反應(yīng)溫度對(duì)微膠囊包埋效果影響如圖4所示,反應(yīng)溫度在30～45 ℃內(nèi),包埋率顯著上升(p<0.05),是因隨溫度升高,壁材間凝聚力增大,交聯(lián)反應(yīng)增強(qiáng);反應(yīng)溫度45 ℃時(shí),包埋率達(dá)到最高;反應(yīng)溫度45～50 ℃內(nèi),包埋率顯著降低(p<0.05),是因溫度過高促使壁材擴(kuò)散速率增大,不利于包埋,其次,對(duì)黃酮具有破壞作用[25]。因此,選取最佳反應(yīng)溫度為45 ℃。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)微膠囊包埋率影響Fig.4 Effect of reaction temperatures on the embedding rate of microcapsules

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 模型建立與顯著性分析 根據(jù)表1響應(yīng)面因素與水平,通過Box-Behnken設(shè)計(jì)得到17組試驗(yàn),方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

利用響應(yīng)面軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ突貧w系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 各因素交互作用對(duì)紅樹莓籽黃酮包埋率影響等高線和響應(yīng)面圖見圖5,響應(yīng)面坡度越陡峭,等高線越扁,均說明微膠囊包埋率對(duì)各因素變化較敏感,各因素對(duì)包埋率的影響顯著。由圖a和圖c可知,AB和BC等高線圖形均較扁,說明交互項(xiàng)AB和BC對(duì)黃酮微膠囊包埋率影響極顯著;圖b和圖d可知,AB響應(yīng)面陡峭程度低于BC響應(yīng)面坡度,說明交互項(xiàng)BC對(duì)微膠囊包埋率影響程度高于AB,故交互項(xiàng)對(duì)微膠囊包埋率影響大小依次為BC>AB,BC和AB對(duì)微膠囊包埋效果影響極顯著。其次,由圖b可知,當(dāng)芯壁比取零水平時(shí),包埋率隨壁材濃度增大呈先升高后降低趨勢,且變化幅度較大,當(dāng)壁材濃度取零水平時(shí),芯壁比對(duì)包埋率影響較小;同理,由d可知,反應(yīng)溫度對(duì)包埋率變化趨勢影響程度低于壁材濃度,但高于圖b中芯壁比對(duì)微膠囊包埋率影響程度,故各因素對(duì)包埋率影響大小依次為B>C>A,與模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。此外,所選因素參數(shù)范圍內(nèi)包埋率均存在極值,可對(duì)紅樹莓籽黃酮微膠囊化最佳工藝進(jìn)行預(yù)測。

圖5 各因素交互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface and contour plots of interation of various factors

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析 響應(yīng)面優(yōu)化紅樹莓籽黃酮微膠囊最佳制備條件:芯壁比1∶4.55、壁材濃度1.01%、反應(yīng)溫度45.53 ℃,此條件下黃酮微膠囊包埋率理論值為91.07%。根據(jù)實(shí)際操作,調(diào)整工藝條件為芯壁比1∶4.6、壁材濃度1%、反應(yīng)溫度46 ℃,三組平行試驗(yàn)表明微膠囊包埋率為92.38±0.16%,相對(duì)誤差1.44%<5%,說明響應(yīng)面優(yōu)化紅樹莓籽黃酮微膠囊制備工藝結(jié)果可靠。

2.3 紅樹莓籽黃酮微膠囊理化特性

紅樹莓籽黃酮微膠囊水分含量5.26%、休止角31.3°、溶解度91.54%、平均粒徑546 nm、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度145.75 ℃,說明此微膠囊產(chǎn)品含水量低、粘度小、流動(dòng)性佳、溶解度高、粒度均勻、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高,故復(fù)凝聚法制備的黃酮微膠囊具有良好貯藏性、流動(dòng)性和溶解性。

2.4 紅樹莓籽黃酮微膠囊體外消化釋放性評(píng)價(jià)

2.4.1 紅樹莓籽黃酮微膠囊體外胃消化釋放性評(píng)價(jià) 紅樹莓籽黃酮及其微膠囊體外胃消化釋放情況如圖6所示,體外胃消化0～2.5 h內(nèi),未包埋的黃酮釋放量顯著升高(p<0.05),是因強(qiáng)酸下胃蛋白酶促進(jìn)了黃酮釋放,與陸俊等[26]研究結(jié)果中黃酮胃消化釋放量變化趨勢相似。胃消化0～0.5 h內(nèi),微膠囊黃酮釋放量增加不顯著(p>0.05),是因微膠囊表面未被包埋的少量黃酮釋放造成,消化至0.5～2.5 h時(shí),微膠囊黃酮釋放量顯著升高(p<0.05),是因壁材逐漸被水解,黃酮釋放出來。胃消化至2.5 h黃酮及微膠囊中黃酮釋放量分別達(dá)77.31和21.88 mg/g,未包埋黃酮釋放量明顯高于微膠囊中黃酮釋放量,是因芯材被包埋于壁材中,避免了直接與胃酸接觸[27],降低了黃酮釋放,說明微膠囊在胃液中對(duì)黃酮有一定緩釋作用,避免了黃酮降解損失。

2.4.2 紅樹莓籽黃酮微膠囊體外腸消化釋放性評(píng)價(jià) 紅樹莓籽黃酮及其微膠囊腸消化釋放情況如圖7所示,腸消化0～2.5 h內(nèi),未包埋的黃酮釋放量顯著升高(p<0.05),隨后顯著降低(p<0.05),說明黃酮在胃消化階段未完全釋放被消化,腸消化液繼續(xù)促進(jìn)了黃酮釋放;腸消化0～2.5 h內(nèi),微膠囊黃酮釋放量顯著升高(p<0.05),隨后趨于平穩(wěn),且腸液中黃酮釋放量顯著高于胃液黃酮釋放量,是因胰蛋白酶為蛋白質(zhì)水解酶,可水解部分微膠囊壁材,從而導(dǎo)致黃酮釋放量升高[28]。廖霞等[8]研究的槲皮素微膠囊包埋前后腸消化過程中釋放量變化趨勢相似。體外腸消化至3 h,未包埋的黃酮及其微膠囊黃酮釋放量分別為158.48和112.51 mg/g,是腸消化0 h的2.05和5.14倍,說明黃酮微膠囊胃消化過程中對(duì)黃酮起到緩釋作用,在腸消化過程被大量釋放,利于黃酮被人體吸收利用。

圖7 模擬腸消化過程中黃酮釋放量的變化Fig.7 Changes in the release of flavonoids during simulated intestinal digestion

3 結(jié)論

通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)凝聚法制備紅樹莓籽黃酮微膠囊工藝,通過單因素實(shí)驗(yàn)確定壁材配比對(duì)微膠囊包埋效果影響較小,故選取芯壁比、壁材濃度和反應(yīng)溫度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,確定最優(yōu)工藝參數(shù)為:芯壁比1∶4.6、壁材濃度1%、反應(yīng)溫度46 ℃,此條件下包埋率92.38%;微膠囊水分含量、休止角、溶解度、粒徑及玻璃化轉(zhuǎn)變溫度分別為5.26%、31.3°、91.54%、546 nm和145.75 ℃,說明微膠囊產(chǎn)品具有較好的貯藏性、流動(dòng)性和溶解性。體外胃消化2.5 h黃酮包埋前后釋放量分別為77.31、21.88 mg/g,未包埋黃酮釋放量為微膠囊中黃酮釋放量3.53倍;體外模擬腸消化3.0 h,黃酮包埋前后釋放量分別為158.48、112.51 mg/g,分別為腸消化0 h的2.05和5.14倍,表明此黃酮微膠囊制備工藝提高了黃酮在胃消化過程中的緩釋作用,促使其在腸消化過程中釋放出來,進(jìn)而被人體吸收利用。