張玉霞 袁小遠(yuǎn) 王友令 孟凱

摘要：為了驗(yàn)證miRNA-2127與p53基因的靶向關(guān)系，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測p53與miRNA-2127的結(jié)合位點(diǎn)，全基因合成法合成該結(jié)合位點(diǎn)的野生型與突變型模板，并將其克隆到pmiR-RB-REPORT??TM?雙熒光素酶報(bào)告載體中，構(gòu)建野生型與突變型重組雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將293T細(xì)胞分為4組，分別共轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告質(zhì)粒+陰性對照（NC）、野生型報(bào)告質(zhì)粒+miRNA-2127、突變型報(bào)告質(zhì)粒+NC、突變型報(bào)告質(zhì)粒+miRNA-2127。檢測各組細(xì)胞中熒光素酶活性差異，結(jié)果顯示：共轉(zhuǎn)染了野生型報(bào)告質(zhì)粒+miRNA-2127的293T細(xì)胞與共轉(zhuǎn)染了野生型報(bào)告質(zhì)粒+NC組相比，熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）;且突變型報(bào)告質(zhì)?粒+?miRNA-2127組的相對熒光素酶活性顯著高于野生型報(bào)告質(zhì)?粒+??miRNA-?2127（P<0.05），說明?miRNA-?2127能夠靶向調(diào)控p53基因，且結(jié)合位點(diǎn)位于3′UTR區(qū)369—375間。

關(guān)鍵詞：p53;miRNA-2127;雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

中圖分類號：S813.10??文獻(xiàn)標(biāo)識號：A??文章編號：1001-4942（2019）01-0001-04

Construction of Dual-Luciferase Reporter

Plasmids by ?3′UTR Region of p53 Gene and

Their Targeted Relationship with miRNA-2127

Zhang Yuxia， Yuan Xiaoyuan， Wang Youling， Meng Kai

（Institute of Poultry Sciences， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250023， China）

Abstract?To verify the targeted relationship between miRNA-2127 and p53， the binding sites of p53 and miRNAs-2127 were predicted by bioinformatics software. The wild-type and mutant templates of the binding sites were synthesized by the whole gene synthesis method， and were cloned into pmiR-RB-REPORT??TM??dual-luciferase reporter vector to construct the wild-type and mutant-type recombinant dual-luciferase reporter plasmids. The cultured monolayer 293T cells were divided into 4 groups including co-transfected wild-type reporter plasmid + NC control， co-transfected wild-type reporter plasmid + miRNA-2127， ?co-?transfected mutant reporter plasmid + NC control and co-transfected mutant reporter plasmid + miRNA-2127， respectively. The difference of luciferase activity in each group was detected. The results showed that compared with co-transfected wild-type plasmid + NC control， the relative luciferase activity of 293T cells in the group with co-transfected wild-type plasmid + miRNA-2127 showed a significant decrease （P<0.05）， and that of co-transfected mutant reporter plasmid + miRNA-2127 group was significantly higher than co-transfected wild-type reporter plasmid + miRNA-2127 group. The results indicated that miRNA-2127 could targeted regulate p53 and the binding sites were located between 369 and 375 in the 3′ UTR region.

Keywords?p53; miRNA-2127; Dual-luciferase reporter system

p53蛋白是一種細(xì)胞核磷酸蛋白，能調(diào)控細(xì)胞生長與基因轉(zhuǎn)錄，被認(rèn)為是一種在許多細(xì)胞進(jìn)程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用的因子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，p53蛋白除了具有腫瘤抑制功能外，其在機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)中也起著重要作用[1]。微小RNA（miRNA）是一類非編碼小RNA分子，長度約19～25 nt，普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)，在進(jìn)化過程中高度保守，其在細(xì)胞增殖、凋亡、應(yīng)激應(yīng)答及新陳代謝等多項(xiàng)生理過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，miRNA調(diào)控著p53基因的表達(dá)[2]。Le等[3]將斑馬魚腦組織中的miR-125b敲除以后發(fā)現(xiàn)p53蛋白水平明顯上調(diào)，miR-125b是p53的負(fù)調(diào)控因子，miR-125b通過直接作用于p53的3′UTR區(qū)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控p53的表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程。之后，又有研究陸續(xù)證實(shí)miR-1285、miR-125a、miR-33和miR-504[4]均可直接作用于p53的3′UTR 區(qū)，從而在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)調(diào)控p53蛋白的表達(dá)。

本研究通過生物學(xué)信息方法預(yù)測p53基因與miRNA-2127的靶向關(guān)系，并試圖通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)來驗(yàn)證二者的靶向關(guān)系，以為后續(xù)研究工作奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

pmiR-RB-REPORT??TM?雙熒光素酶報(bào)告載體及檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司;人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞系購自ATCC公司;DH5α感受態(tài)本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基、OPTI-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清均為Gibico產(chǎn)品;Lipofectamine??TM??3000為天根品牌。

TIAN prep Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒、Universal DNA Purification Kit DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;限制性內(nèi)切酶（XhoⅠ、NotⅠ）、DNA聚合酶、普通DNA聚合酶購自Thermo公司;蛋白胨、酵母提取物為OXOID公司產(chǎn)品;氨芐青霉素為Sigma產(chǎn)品。

1.2?miRNA-2127與p53基因靶向關(guān)系的生物信息學(xué)預(yù)測

參考miRNA數(shù)據(jù)庫（http：//www.mirbase.org）利用生物信息學(xué)方法（TargetScan、PicTar、miRanda）分析預(yù)測p53與miRNA-2127的靶向關(guān)系。

1.3?p53基因3′UTR序列擴(kuò)增與合成

經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測，miRNA-2127與p53基因3′UTR區(qū)結(jié)合，通過全基因合成方法合成p53 3′UTR區(qū)全基因模板（即野生型），然后通過改變miRNA-2127與3′UTR結(jié)合位點(diǎn)（369—375）的氨基酸序列使miRNA-2127不能與p53的3′UTR區(qū)結(jié)合（即突變型）。野生型與突變型均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4?雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

用XhoⅠ、NotⅠ分別對p53野生型與突變型基因模板以及pmiR-RB-REPORT??TM?載體進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系如下：10×H緩沖液4 μL，DNA約2 μg，內(nèi)切酶（10 U/μL）各1 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足到40 μL，置37℃作用4 h。酶切后按照純化試劑盒說明書進(jìn)行純化回收。

取回收的目的片段DNA 2 μL（約150 ng），載體0.5 μL（約50 ng），solution I快速連接液5 μL， 滅菌去離子水補(bǔ)足到10 μL，16℃連接30 min。取連接產(chǎn)物加到100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴30 min。將上述轉(zhuǎn)化液置于42℃水浴90 s，取出后立即置于冰浴中放置2～3 min。向其中加入900 μL 37℃預(yù)熱的LB（不含抗生素）培養(yǎng)基，150 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)45 min。2 500 r/min離心5 min，棄上清，留100 μL混勻菌液，置于含Amp抗生素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12～16 h。

1.5?PCR鑒定及測序

挑取上述平板上的單菌落，溶入3 μL水中，取0.5 μL做模板，進(jìn)行PCR鑒定。采用10 μL反應(yīng)體系：10×Taq buffer 1 μL，25 mmol/L MgCl2 1.6 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 5 μL，載體上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶?（2.5??U/μL）0.3 μL，DNA模板0.5 μL（約100 ng），用滅菌水補(bǔ)足10 μL體系。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min;循環(huán)內(nèi)95℃變性30 s，56℃退火，72℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán);PCR反應(yīng)循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸3 min。結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行?1.5%?瓊脂糖電泳分析。

回收PCR產(chǎn)物，將其連接至pGEM-T Easy Vector載體中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α，均勻涂布于含Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板中常規(guī)培養(yǎng)。16 h作用挑取白色菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定合格菌液送華大基因公司一代測序法測序。

1.6?細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以每孔1.5×10?4個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔總體積100 μL，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。選用對數(shù)生長期細(xì)胞，試驗(yàn)共分4組：A組為共轉(zhuǎn)染陰性對照?（non-?target control，NC）和野生型報(bào)告質(zhì)粒組;B組為共轉(zhuǎn)染miR-2127和野生型報(bào)告質(zhì)粒組;C組為共轉(zhuǎn)染陰性對照與突變型報(bào)告質(zhì)粒組;D組為共轉(zhuǎn)染miR-2127與突變型報(bào)告質(zhì)粒組。取2 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋miR-2127或陰性對照NC，3 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋靶基因野生型或突變型報(bào)告質(zhì)粒，5 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋0.225 μL Lipofectamine??TM??3000試劑，三者混合，共10 μL，輕輕搖勻，靜置15 min。將培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞液吸棄，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基，然后加入上述混合液10 μL，最終每孔總體積100 μL。其中miR-2127轉(zhuǎn)染濃度均為50 nmol/L，質(zhì)粒濃度為100 ng/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.7?各組熒光素酶活性檢測

轉(zhuǎn)染48 h后吸出培養(yǎng)基，以35 μL/孔加入PBS，并加入luciferase底物35 μL/孔，振蕩10 min，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書，測定293T細(xì)胞中的熒光值。

1.8?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)

采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，比較4組細(xì)胞中熒光值的差異。

2?結(jié)果與分析

2.1?p53基因野生型及突變型報(bào)告質(zhì)粒的PCR鑒定

隨機(jī)挑取突變型和野生型菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定，擴(kuò)增的條帶理論大小為636 bp，其實(shí)際擴(kuò)增條帶如圖1所示，與預(yù)期片段大小一致。

2.2?p53基因野生型及突變型報(bào)告質(zhì)粒測序結(jié)果

由圖2測序結(jié)果可見，已成功將靶序列ACTGAAA （369—375）突變?yōu)門GACTTT。

2.3?各組細(xì)胞中熒光素酶活性變化

一般條件下，miRNA跟NC對照相比，野生型載體報(bào)告熒光有所下調(diào)，則認(rèn)為miRNA對報(bào)告基因有調(diào)節(jié)作用[5]。由圖3可見，miRNA-2127+野生型報(bào)告質(zhì)粒組293T細(xì)胞中的相對熒光素酶活性較NC+野生型報(bào)告質(zhì)粒組顯著降低（P<?0.05），?證明miRNA-2127能有效抑制野生型質(zhì)粒熒光素酶的活性;miRNA-2127+突變質(zhì)粒報(bào)告組293T細(xì)胞中的相對熒光素酶活性顯著高于miRNA-?2127+?野生型質(zhì)粒報(bào)告組（P<0.05）。證明miRNA-2127質(zhì)粒無法抑制突變型熒光素酶活性。因此表明miRNA-2127與預(yù)測到的p53基因3′UTR位點(diǎn)有明顯的相互作用。

3?討論與結(jié)論

p53基因是迄今為止已發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的基因，野生型p53基因通過調(diào)控細(xì)胞周期內(nèi)的增殖、分化和凋亡來維持生物機(jī)體內(nèi)基因組和細(xì)胞的穩(wěn)定，可抑制腫瘤生長，而突變型p53基因則能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，誘導(dǎo)原位癌的形成，該突變位點(diǎn)可應(yīng)用于腫瘤的早期診斷[6]。p53蛋白除了作為熱門的腫瘤抑制蛋白被大量研究之外，還被發(fā)現(xiàn)是宿主天然免疫因子，其對不同種類病毒復(fù)制的抑制作用不斷被證實(shí)。2003年Takaoka等[7]首次報(bào)道p53具有抗水泡性口炎病毒的作用，研究還發(fā)現(xiàn)p53蛋白能夠抑制新城疫病毒[8]、傳染性法氏囊病毒[9]、脊髓灰質(zhì)炎病毒等的復(fù)制。2006年，Voorhoeve等[10]在篩選人miRNA時(shí)首次發(fā)現(xiàn)miRNA參與p53信號通路，是p53信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子，miRNA通過特異結(jié)合mRNA，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制，從而參與調(diào)控細(xì)胞的生長與凋亡。因此通過挖掘調(diào)控p53的miRNA，可為宿主抗擊疾病提供更深層次的解讀，也可為開發(fā)更廣譜的抗腫瘤和病毒的基因藥物奠定基礎(chǔ)。

構(gòu)建合適的報(bào)告載體，對增加或降低p53蛋白含量的miRNA進(jìn)行篩選非常重要。本研究經(jīng)PCR和測序鑒定，證實(shí)已成功構(gòu)建p53基因的雙熒光素酶報(bào)告表達(dá)載體。雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)顯示miRNA-2127+野生型熒光素酶活性較陰性對照+野生型對照明顯降低，提示miRNA-2127可直接作用于p53基因的3′UTR區(qū)，抑制其熒光素活性。這為進(jìn)一步研究miRNA提供了基礎(chǔ)。

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