李臻 潘教文 王慶國 劉煒

摘要：本課題組在對水稻病害的研究中，鑒定并克隆到一個羧酸酯酶基因?OsCDAP?。為進一步研究該酯酶生物學功能，構建了?OsCDAP?植物過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導的方法轉化水稻“中花11”。轉基因水稻表型分析顯示，過表達轉基因水稻植株株高略高于對照，其第一節(jié)間長度明顯長于對照，而第五節(jié)間長度明顯短于對照，其他節(jié)間長度差異不明顯;?OsCDAP?過表達株系的劍葉夾角明顯大于對照。進一步對轉基因水稻GA和BR合成及信號轉導相關基因進行分析，發(fā)現(xiàn)部分基因的表達發(fā)生改變。本試驗結果顯示?OsCDAP?可通過調控內源GA和BR的含量及參與相關信號途徑調控水稻節(jié)間長度及葉夾角大小，進而對水稻的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。

關鍵詞：水稻;羧酸酯酶OsCDAP;株高;節(jié)間長度;劍葉夾角;赤霉素;油菜素內酯;基因表達

中圖分類號：S511.03??文獻標識號：A??文章編號：1001-4942（2019）01-0008-06

Biological Function Analysis of Carboxylesterase OsCDAP in Rice

Li Zhen?Pan Jiaowen?Wang Qingguo?Liu Wei

（1. Biotechnology Research Center/Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，

Ecology and Physiology， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;

2.College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014，China）

Abstract?Our research group cloned and indentified a carboxylesterase gene OsCDAP in the study of rice diseases. In order to study its function， an over-expression vector containing OsCDAP was constructed， and the transgenic lines of rice Zhonghua 11 were harvested through Agrobacterium-mediated transformation. Phenotype analysis showed that the plant height of OsCDAP over-expressed rice was slightly higher than that of control. The length of the first internode of transgenic strains was significantly longer than that of control， while the length in the of the fifth internode was significantly shorter than that of the control. There were almost no significant differences in the other internode length between transgenic strains and control. The leaf angles of flag leaves of transgenic strains were significantly larger than those of control. The expressions of GA and BR synthesis and signal transduction genes were also changed corresponding to the phenotypes variation. The results indicated that OsCDAP might regulate rice internode length and leaf angle by regulating the GA and BR synthesis and participating in signal transduction， which eventually lead to the variation of growth and development of rice.

Keywords?Rice; Carboxylesterase OsCDAP; Plant height; Internode length; Flag leaf angle; GA; BR; Gene expression

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米作為主食。隨著全球人口的增加和耕地面積的減少，選育優(yōu)質高產(chǎn)的水稻品種對于維系世界糧食安全具有重要意義。株高及葉夾角是水稻株型形成的關鍵因素，與產(chǎn)量密切相關[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻體內多種基因參與株高及葉夾角的調控過程。其中生長素（auxin， IAA）、赤霉素（gibberellin， GA）以及油菜素內酯（brassinolide，BR）在調控株高及葉夾角形成過程中均發(fā)揮重要作用。半矮稈基因SD1的發(fā)現(xiàn)帶來第一次綠色革命，該基因編碼GA合成途徑關鍵酶GA20ox-2氧化酶基因，該位點的突變可以導致水稻不同程度的矮化[3];其他參與GA合成的基因如水稻貝殼杉烯氧化酶基因OsKO2[4]、GA氧化酶基因GA20ox1[5]以及GA3β羥基化酶基因OsGA3ox2[6]的缺失突變，均可導致水稻植株矮化。而BR合成基因D2、D11以及OsBR6ox等基因的缺失，不但導致突變體水稻株高降低，還能導致葉夾角變小[7-9]。SMOS1和DLT是BR、IAA和GA互作的關鍵基因，其功能缺失導致植株出現(xiàn)矮化、節(jié)間變短、葉片直立等表型[10，11]。

羧酸酯酶是一大類水解酶家族，參與多種生物學過程，在植物生長發(fā)育、植物與病原物的互作、除草劑等植物毒素的代謝、植物激素信號物質的活化以及植物響應脅迫等過程發(fā)揮重要作用[12-15]。課題組前期在水稻中克隆到一個羧酸酯酶基因?OsCDAP?（LOC_Os11g04350），該基因在水稻莖中高表達，并受GA誘導，GA抑制劑PAC可抑制其表達[16]。本研究通過構建?OsCDAP?過表達載體，用農(nóng)桿菌介導的方法轉化水稻愈傷組織，再經(jīng)多代篩選和鑒定，獲得過表達?OsCDAP?的轉基因株系，并對其表型進行分析，以期更好地解析羧酸酯酶在植物中的功能及為水稻育種研究提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

植物材料：水稻“中花11”種子由本實驗室保存。

菌株與載體：大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自Transgen公司（濟南雨同生物科技有限公司）;農(nóng)桿菌菌種LBA4404及含有目的基因的克隆載體pMD18-T-CDAP由本實驗室保存;植物雙元表達載體p1301-?bar?-UBI由山東農(nóng)業(yè)大學溫孚江教授惠贈，該載體是以pCAMBIA1301為骨架改造而成，含有除草劑Basta篩選基因和單子葉植物Ubiqutin啟動子。

主要試劑：限制性內切酶、T4 DNA ligase 以及RNA反轉錄試劑盒PrimeScript??TM??1st Strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A） 均購自TaKaRa公司（大連寶生物）;植物RNA提取試劑盒TransZol Plant （Code： ET101-01） 以及高保真?Taq??DNA Polymerase購自Transgen 公司;質粒提取試劑盒及凝膠回收試劑盒購自博大泰克生物技術有限公司;熒光定量PCR所用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（Code：13135900）試劑購自羅氏公司;除草劑PPT購自Sigma公司;除草劑Basta（有效成分PPT=18%）購自日本農(nóng)藥株式會社;所用引物均由上海英濰捷基公司合成;其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2?植物表達載體的構建及水稻的遺傳轉化

用?Pst??I和?Bam?H I分別雙酶切含有目的基因的克隆載體pMD18-T-CDAP以及植物雙元表達載體p1301-?bar?-UBI，切膠回收目的基因片段和線性化的植物表達載體，經(jīng)T4 ligase連接，將酶切鑒定正確的陽性重組質粒命名為p1301-?bar?-?OsCDAP?。構建成功的植物雙元表達載體用熱激法轉入農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，侵染水稻愈傷組織，用10 mg/L的PPT進行3次抗性篩選，經(jīng)誘導及分化獲得轉基因組培苗。

將培養(yǎng)基上的轉基因苗移栽至土中，待生長至6葉期，用濃度0.2%Basta溶液涂抹葉片進行抗性篩選。篩選出的陽性苗，提取葉片DNA，利用基因上游引物OsCDAPF（5′-GCCAAGATAGCAAGAGAGTCC-3′）與植物表達載體上的Nos（5′- CCCGATCTAGTAACATAGAT-3′）下游引物組合檢測過表達轉基因陽性植株，并經(jīng)多代篩選獲得純合株系。

1.3?RNA的提取及反轉錄

按照TransZol Plant 試劑盒說明書提取水稻組織總RNA，并參照TaKaRa PrimeScript??TM??1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書將檢測合格的RNA反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.4?實時熒光定量PCR

根據(jù)GA及BR合成及信號轉導相關基因全長序列設計實時熒光定量PCR引物，所用基因名稱及引物序列見表1。反應在ABI PRISM 7900 HT（Applied Biosystems）熒光定量PCR儀上進行，反應體系為20 μL，方法參照FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）說明書。反應條件：95℃ 10 min;95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。按照2??-ΔΔCT?法計算基因的相對表達量。

1.5?轉基因株系表型分析

成熟期水稻株高：以生長到抽穗期結束的水稻為材料，測定莖基部至穗頂部的長度;成熟期水稻節(jié)間：以每株水稻主要分蘗為材料，從第一節(jié)開始測定每節(jié)長度，一共測量5節(jié);成熟期水稻穗長：以每株水稻主要分蘗為材料，測定從穗部節(jié)到穗頂部的長度;成熟期水稻劍葉夾角：以生長到抽穗期結束的水稻為材料，利用量角器測定劍葉與主莖之間的角度，每株系測量20株。

1.6?數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理并作圖，利用SPSS 23.0進行差異顯著性分析。

2?結果與分析

2.1?轉基因株系的獲得

轉基因組培苗經(jīng)繼代、Basta抗性篩選及PCR鑒定，最終獲得過表達轉基因株系7個。通過熒光定量PCR檢測轉基因株系中基因的表達量，結果顯示，轉基因株系中?OsCDAP?基因的表達量明顯上升，表明?OsCDAP?基因成功轉入水稻植株（圖1）。根據(jù)各株系中基因表達量的差異，選取OE1、OE3和OE5三個株系，分別命名為OECDAP1、OECDAP2和OECDAP3，其基因表達量分別為對照的78.24倍、128.41倍和407.38倍，以這三個株系為基礎開展下一步研究。

2.2???OsCDAP?轉基因株系表型分析

對OECDAP1、OECDAP2、OECDAP3各株系進行株高、節(jié)間長度、穗長以及劍葉夾角統(tǒng)計，結果顯示，轉基因水稻的株高和穗長與對照相比沒有顯著差異。過表達水稻植株的第一節(jié)間長度與對照植株相比差異顯著，OECDAP1、OECDAP2、OECDAP3第一節(jié)間長度分別為43.04、41.42、41.56 cm，各為對照的1.10、1.06、1.07倍;而各轉基因株系第五節(jié)間長度均短于對照，且過表達轉基因株系OECDAP1、OECDAP2的長度與對照相比差異顯著，分別為2.04 cm和2.19 cm，其他節(jié)間長度差異不明顯（圖2，圖3）。各過表達株系的劍葉夾角均顯著大于對照，對照植株的劍葉夾角大部分處于30°到60°之間，最大角度不會超過100°，而各轉基因株系劍葉夾角大部分處于120°到150°之間，最小角度在100°左右（圖4）。

2.3???OsCDAP?過表達轉基因株系中GA及BR相關基因的表達分析

鑒于GA和BR在節(jié)間伸長和葉夾角調控中發(fā)揮重要作用，因此檢測了各轉基因水稻株系中參與GA及BR合成及信號轉導關鍵基因的表達變化，發(fā)現(xiàn)：各轉基因株系中GA合成相關基因OsGA3ox-2、OsGA2ox-3、OsGA20ox-1、OsGA20ox-3的表達與對照相比變化均不明顯，但OsGA20ox-2和SLR1在各轉基因株系中表達均上調（圖5）。OsGA20ox-2表達量上調最高為對照3.89倍，SLR1表達量上調最高為對照2倍。BR合成相關基因D2、D11表達下調，而OsBR6ox表達明顯上調，表達量最高為對照5倍;BR信號轉導相關基因表達上調，其中OsBAK1表達上調明顯，最高為對照?5.74?倍（圖6）。

3?討論與結論

節(jié)間是水稻生活力最旺盛的部位，節(jié)間數(shù)目與著生在節(jié)基部的葉片數(shù)目對應，一般有十幾個不等，但只有地面以上的4～5個節(jié)間才是株高的主要構成部分。課題組前期研究顯示?OsCDAP?在水稻莖中表達量明顯高于其他組織，顯示該基因可能參與水稻莖稈的伸長[16]。對成熟期水稻株高、穗長及節(jié)間長度進行測量發(fā)現(xiàn)，該基因的過表達轉基因株系整體株高及穗長都略高于或長于對照，但是差異不顯著;過表達水稻株系的第一節(jié)間長度明顯長于對照，而第五節(jié)間長度明顯短于對照，其他節(jié)間長度差異不明顯。推測該基因參與水稻節(jié)間發(fā)育過程，水稻中節(jié)間伸長過程受到多個基因的協(xié)同調控，許多編碼GA生物合成和信號轉導途徑相關的基因都與水稻節(jié)間伸長密切相關[17]，如水稻GA13氧化酶基因CYP714B1和CYP714B2，能夠降低內源GA的生物活性，這兩個基因的雙突變體倒一節(jié)間相比于對照更長;EUI1基因參與GA合成的反饋調控，該基因的缺失突變體可導致水稻頂部節(jié)間異常伸長[18，19]。利用熒光定量對GA合成及信號轉導相關基因的表達進行測定發(fā)現(xiàn)，GA合成關鍵基因OsGA20ox-2和信號轉導關鍵基因SLR1表達上調。研究發(fā)現(xiàn)，OsGA20ox-2能夠催化GA53轉化成GA20，該基因的突變能夠導致植株中GA53的積累，GA20和有活性的GA1含量降低，從而產(chǎn)生水稻半矮稈表型[20]。在本研究中，過表達轉基因株系中OsGA20ox-2的表達上調能夠提高活性GA1的積累，從而促進莖稈伸長。SLR1編碼一個DELLA蛋白，是GA信號傳導的負調控因子，也能整合并放大水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）介導的防衛(wèi)信號，在調控水稻生長和先天免疫反應中發(fā)揮多重作用[21]。研究表明GA的信號傳導受SLR蛋白出現(xiàn)和消失的控制，即GA達到一定濃度時，SLR蛋白消失，GA的信號得以傳導下去，但GA反過來刺激SLR的轉錄和翻譯，從而抑制GA的傳導[22]。推測過表達?OsCDAP?基因能夠調節(jié)活性GA1含量增加從而刺激?SLR?的轉錄，使轉基因株系中?SLR?基因表達量升高。對?OsCDAP?基因是否通過調控水稻內源GA活性，從而調控水稻節(jié)間的發(fā)育還需要進一步驗證。

水稻葉夾角是水稻品種的重要評價指標，與水稻的生產(chǎn)和抗病性息息相關，合適的葉夾角可以使植株具有良好的光捕獲能力，提高植株光合作用效率。已知植物激素參與葉夾角的調控，迄今鑒定到調控葉夾角的大多數(shù)基因都與BR合成及信號轉導途徑有關。例如：水稻BR合成關鍵基因D2和D11的突變體表型均為：葉夾角明顯減小，葉片直立，莖稈短而粗，上部第2節(jié)間明顯比野生型短甚至不伸長[7，8]。在本研究中D2和D11這兩個基因表達均下調，但是轉基因株系葉夾角反而變大，與D2和D11缺失突變體表型相反，進一步分析發(fā)現(xiàn)另外一個BR合成的關鍵基因OsBR6ox表達明顯上調，推測由于該基因的上調回補了D2和D11的下調表型，導致葉夾角變大。另外BR信號轉導相關基因OsBAK1表達明顯上調，OsBAK1是OsBRI1的共受體，研究表明OsBAK1的表達會改變水稻多個重要農(nóng)藝性狀，如：株高、葉夾角、粒型和抗病性[23]。通過抑制OsBAK1的表達，可以在不影響生殖生長的情況下獲得直立葉的表型，OsCDAP基因是否通過調控該基因的表達從而調控葉夾角的大小，還需要進一步驗證。

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