梁偉 趙亞慧 杜海巖 咸洪泉 崔德杰

摘要：為探討微生物菌劑對緩解花生連作障礙的作用，利用篩選分離出的化感物質(zhì)降解菌和抗病原微生物拮抗菌布置田間試驗，研究不同菌劑處理對連作花生生長、生理特性等的影響。試驗共設(shè)4個處理：T0（不施用菌劑）、T1（細(xì)菌處理）、T2（真菌處理）、T3（復(fù)合菌劑處理）。結(jié)果表明：施用菌劑處理均能有效提高花生的光合能力，以復(fù)合菌劑處理最為顯著;復(fù)合菌劑的加入能顯著提高花生葉片可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性，降低MDA含量，有效維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性;開花下針期是生物量快速積累時期，地上部生物量符合Logistic方程，與T0相比，施菌劑處理均能顯著提高花生生物量;復(fù)合菌劑處理莢果產(chǎn)量兩年分別達(dá)?3 608.7 kg/hm2和?3 486.4kg/hm2?，較T0處理分別提高336.3 kg/hm2和368.1 kg/hm2。復(fù)合菌劑的施用能有效促進花生生長，緩解花生連作障礙。

關(guān)鍵詞：花生連作;降解菌;微生物菌劑;生理特性

中圖分類號：S565.2文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）01-0079-06

Effects of Resistant Continuous Cropping Microbial Agents on Growth and Physiological Characteristics of Peanut

Liang Wei， Zhao Yahui， Du Haiyan， Xian Hongquan， Cui Dejie

（College of Resources and Environment， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）

Abstract?The effects of different microbial agents on physiological characteristics of peanut under continuous cropping were studied in order to discuss the role of microbial agents on continuous cropping barrier mitigation. Four treatments were designed as control （T0）， bacterial treatment （T1）， fungi treatment （T2） and mixed microbial agent （T3）， which were degraded bacteria or fungi of allelochemicals and antipathogenic antagonist. The results showed that photosynthesis was improved by all microbial agent treatments， especially T3 treatment. The soluble protein content and the activity of antioxidant enzymes of peanut leaves increased significantly，theMDA content decreased and the membrane structure stability was maintained effectively by adding compound microbial agent. The flowering-needle period was the one for fast accumulation of biomass， and the above-ground biomass was in accord with the Logistic equation. The peanut biomass could be improved by microbial agent treatments compared with T0 treatment. The yield of pods treated with compound microbial agents reached 3 608.7 kg/hm?2 and 3 486.4 kg/hm?2 in the two years， respectively， which increased by336.3kg/hm?2 and 368.4 kg/hm?2 compared with T0 treatment. The application of compound microbial agent could effectively promote the growth of peanut and alleviate the continuous cropping obstacle.

Keywords?Continuous cropping of peanut; Dedrading bacteria; Microbial agent; Physiological characteristics

花生是我國重要的經(jīng)濟作物，連年種植易導(dǎo)致根際微生物區(qū)系真菌化，而且根系分泌的化感自毒物質(zhì)不斷積累，當(dāng)其積累到一定程度時便會產(chǎn)生化感自毒作用，使花生病蟲害加劇，嚴(yán)重抑制花生的生長，現(xiàn)已認(rèn)為這是花生產(chǎn)生連作障礙的主要因子[1-5]。袁云云等[5]研究表明，連作花生根系分泌的十六烷酸、油酸、鄰苯二甲酸等化感物質(zhì)對花生生長有抑制作用。

篩選微生物拮抗菌劑和化感自毒物質(zhì)降解菌劑，并進行微生物在土壤中的定向培育與馴化，將有助于減輕化感物質(zhì)對植物的危害，緩解連作障礙。施用微生物制劑可以增加土壤細(xì)菌數(shù)量，花生SOD活性提高[6-9]。封海勝等[10]研究表明微生物制劑可以顯著促進連作花生的植株生育，使其單株結(jié)果數(shù)、飽果數(shù)、百果重、產(chǎn)量等達(dá)到或超過輪作花生的水平。植物的化感作用是釋放的所有化感物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，且是至少兩種或兩種以上物質(zhì)相互作用，大田土壤中除了植物釋放的化感物質(zhì)外還包括多種物質(zhì)可能會與化感物質(zhì)發(fā)生相互作用[11，12]。然而目前使用的抗花生連作菌劑大多為單一菌種，功能單一，緩解化感自毒作用的程度有限[13，14]，而且土壤環(huán)境中很多因素都限制添加拮抗菌或降解菌在土壤中的定殖和增殖，使其難以發(fā)揮應(yīng)有效果。為此，本研究利用從連作花生土壤中篩選出且對病原菌有拮抗作用的真菌A1黃色藍(lán)狀菌（?Talaromyces flavus?）和降解花生主要化感物質(zhì)（油酸、十六烷酸、鄰苯二甲酸）的A2里拉微球菌（?Micrococcus lylae?）、A3紫金牛葉桿菌（?Phyllobacterium myrisacearum?）和A4理氏勒米諾氏菌（?Leminorella richardii?）三種細(xì)菌為供試菌種，并按各種菌的特性優(yōu)化組合制備復(fù)合菌劑進行大田試驗，研究其對花生生長、光合特性及氧自由基代謝相關(guān)酶活性動態(tài)變化規(guī)律等方面的影響，旨在為探究復(fù)合菌劑在緩解花生連作障礙上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試花生品種為花育25號。供試菌種：從7年連作花生地篩選出的花生化感物質(zhì)降解菌和抗連作生防菌，分別是對病原菌有拮抗作用的真菌A1黃色藍(lán)狀菌和分解油酸的A2里拉微球菌、分解十六烷酸的A3紫金牛葉桿菌、分解鄰苯二甲酸的A4理氏勒米諾氏菌三種細(xì)菌（均已獲得國家發(fā)明專利）。供試培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）、馬丁氏培養(yǎng)基。供試土壤基礎(chǔ)肥力狀況和pH值見表1。

1.2?試驗處理[HT]

試驗于2015、2016年在山東省萊西市三農(nóng)富康科技示范園內(nèi)進行。試驗共設(shè)4個處理：T0（不施菌劑）、T1（細(xì)菌處理）、T2（真菌處理）、T3（復(fù)合菌劑處理），具體見表2。播種前將菌液與麩皮拌勻進行撒施，用量為（200 mL+3 kg）/小區(qū)，復(fù)合菌劑中降解菌有效活菌數(shù)總數(shù)達(dá)24×108cfu/mL，拮抗菌有效活菌數(shù)1.1×108cfu/mL。基肥為復(fù)合肥（N-P?2?O?5?-K?2?O=13-15-12），施用量1 250 kg/hm2?。小區(qū)面積35 m2?，每小區(qū)4行，行距42 cm，株距18 cm。隨機區(qū)組排列，重復(fù)3次。2015年5月3日播種，9月10日收獲;2016年5月3日播種，9月17日收獲。其它按常規(guī)田間管理進行。

1.3?測定項目與方法[HT]

于出苗25 d起開始取樣，每15 d取樣一次。105℃殺青0.5 h，75℃烘至恒重，稱重。按小區(qū)收獲莢果，曬干后放入室內(nèi)平衡10 d，稱量計產(chǎn)，計算單株結(jié)果數(shù)、百果重和出仁率等。地上部生物量累計特征值用Logistic曲線擬合，方程為y=Wm/（1+ae-bt?），求其一階、二階、三階導(dǎo)數(shù)，分別得曲線相應(yīng)的快速積累起始時間（t?1?）、快速積累終止時間（t?2?）、最大積累速率（V?m?）、最大積累速率出現(xiàn)時間（t?m?）。

生理指標(biāo)的測定：每小區(qū)采倒三葉10片，液氮冷凍保存。硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛（MDA）含量;氮藍(lán)四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性;愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[15]。考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白含量。

光合特性的測定：采用英國Hansatech公司的葉綠素?zé)晒鈨x測定最大熒光

（F?m?）、初始熒光（F?o?）、表觀光合電子傳遞速率（ETR）。根據(jù)Schreiber和Genty等[16，17]的方法計算出可變熒光（F?v?=F?m?-F?o?）、最大光化學(xué)效率（F?v?/F?m?）、潛在光化學(xué)活性（F?v?/F?o?）;用Li-6400光合分析儀測定單葉凈光合速率。

1.4?數(shù)據(jù)處理[HT]

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和SPSS 19.0等軟件進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析和做圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?微生物菌劑對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[HT]

F?v?/F?m?表示原初光能轉(zhuǎn)化效率與PSⅡ潛在量子效率，其值大小與光合電子傳遞活性成正比[18]。由圖1可知，各處理間F?v?/F?m?值分別為?0.80?、0.81、0.82、0.83，差異不顯著。ΦPS Ⅱ是PSⅡ的實際光化學(xué)效率，反映葉片用于光合電子傳遞的能量占所吸收光能的比例[19]。圖1顯示，施用菌劑處理與T0差異顯著，其中以T3最大，說明施用菌劑處理的花生實際光能利用率加大，用于光電子傳遞的能量比例顯著提高。

2.2?微生物菌劑對功能葉凈光合速率的影響[HT]

光合速率的大小是作物光合能力的反映，是作物產(chǎn)量的必要前提[20]。表3顯示，各處理功能葉片凈光合效率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，至出苗55 d，光合速率達(dá)到最大值。施用菌劑處理均高于對照，以復(fù)合菌劑T3處理最好，各時期比T0提高1170%～1585%，差異達(dá)顯著水平。說明菌劑的加入有效提高了花生葉片的光合速率，特別是復(fù)合菌劑處理。

2.3?微生物菌劑對葉片超氧化物岐化酶（SOD）活性的影響[HT]

SOD普遍存在于植物體內(nèi)，是一種清除O·-?2的酶，能防止細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到破壞，是植物衰老特征的重要指標(biāo)[21]。圖2所示，各處理SOD活性呈先增后減趨勢，施用菌劑處理顯著高于對照，以T3處理最大。其值在出苗70 d時達(dá)到最大，此時期T3處理兩年分別比T0提高10.6%和133%。說明施入菌劑能不同程度地影響花生葉片的SOD活性，且復(fù)合菌劑比單一菌劑效果要好。

2.4?微生物菌劑對葉片過氧化物酶（POD）的影響[HT]

POD是細(xì)胞清除葉綠體中H?2?O?2?的主要酶之一，其活性的高低可以反映活性氧清除能力的強弱[22]。由圖3可知，各處理花生葉片中POD活性呈先增后降趨勢，于出苗70 d時達(dá)到最大。T3處理POD活性處于較高水平，明顯高于其它處理，比T0高10.1%～22.5%。說明復(fù)合菌劑比單一菌劑處理更能有效提高花生葉片POD活性，保護膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2.5?[JP3]微生物菌劑對葉片丙二醛（MDA）含量的影響[HT]

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量高低與植株的衰老密切相關(guān)[23]。由圖4可見，花生生育期內(nèi)MDA含量基本呈現(xiàn)上升趨勢。兩年施菌劑處理T1、T2、T3分別比T0低3.3%～9.7%、 7.1%～14.3%和 18.8%～19.0%。正常情況下氧自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，隨著花生生育期的推進，SOD和POD活性等下降，導(dǎo)致MDA含量增加，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，不可避免地導(dǎo)致植物衰老死亡。菌劑的加入能有效減緩衰老進程，以復(fù)合菌劑處理效果最好。

2.6?微生物菌劑對葉片可溶性蛋白含量的影響[HT]

可溶性蛋白作為葉片光合產(chǎn)物代謝的重要指標(biāo)，其含量關(guān)系到與作物生長發(fā)育相關(guān)的酶，也是植物衰老的最常見指標(biāo)之一[24]。從圖5可以看出，主功能葉可溶性蛋白含量約在出苗后55 d達(dá)到最大，之后開始快速下降，約在85 d時降幅變小，其含量只相當(dāng)55 d時的73.8%。各階段可溶性蛋白含量的多少基本為T3﹥T2﹥T1﹥T0， 且T3、T2、T1與T0之間表現(xiàn)為顯著性差異。說明復(fù)合菌劑能有效提高植株葉片可溶性蛋白含量，進而間接反映出復(fù)合菌劑的加入可有效提高花生的光合能力。

2.7?微生物菌劑對地上部生物量積累的影響[HT]

由表4可知，各處理花生生物量積累符合Logistic方程，各菌劑處理地上部生物量最大積累量均高于對照，以T3生物量最高，最大積累速率最高，說明施復(fù)合菌劑能提高花生生物量的積累。T0和T3處理生物量快速積累起始較早，持續(xù)時間一般在39 d左右，但是T3處理最大積累速率明顯高于T0?？赡苁请S著生育期的推進，菌劑在不斷改善連作土壤的微生物區(qū)系，使得真菌化的土壤向細(xì)菌化過度，良好的土壤環(huán)境利于作物生長及生物量的積累。

2.8?微生物菌劑對花生產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響[HT]

如表5所示，除2015年的T1處理外，兩年中各菌劑處理均可顯著提高花生莢果產(chǎn)量、百果重等。T3處理莢果產(chǎn)量最高，兩年分別為3 608.7 kg/hm2?和3 486.4 kg/hm2?，較T0增加336.3kg/hm2和368.1 kg/hm2?，同樣與菌劑單施處理間差異也達(dá)顯著水平，比T1和T2處理分別提高?8.1%、?7.8%和4.8%、5.1%。百果重也以T3最高，兩年分別比對照提高12.9%和14.6%。

3?討論

花生連作條件下，根系分泌的酚酸類有機酸等不斷積累，定向影響著土壤及根際微生物的生長發(fā)育和繁殖，形成了特定的連作花生土壤微生物類群，土壤有益菌數(shù)量減少，而花生根系分泌物又和土壤微生物區(qū)系存在極密切關(guān)系[25]，反過來影響花生根系分泌物，進而影響化感作用的強弱。根系分泌的化感自毒物質(zhì)積累會抑制花生對養(yǎng)分的吸收、使作物光合產(chǎn)物減少以及破壞花生的細(xì)胞膜穩(wěn)定性等，最終影響花生產(chǎn)量和品質(zhì)。研究中發(fā)現(xiàn)，各菌劑處理特別是復(fù)合菌劑處理，實際光化學(xué)效率、凈光合速率等顯著高于空白處理，這與尤升波等[26]的研究結(jié)果基本一致?？赡苁菑?fù)合菌劑補充了有益微生物，抑制病原菌的生長，并且可以降解土壤中主要的化感物質(zhì)，減輕分泌物的化感自毒作用，進而促進植物根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。根系對養(yǎng)分的吸收利用激發(fā)了作物的光合能力，在提高光合電子傳遞的同時減少了熱耗散，這有利于碳水化合物的形成，是作物高光合產(chǎn)量的重要保障。試驗中復(fù)合菌劑處理的地上部生物量較高，說明復(fù)合菌劑的加入能有效提高連作花生的光合能力，保證花生正常生長。

SOD、POD是植物抗氧化酶系統(tǒng)中的主要酶類，能清除植物體內(nèi)的活性氧自由基，正常情況下其產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。花生根系分泌物的積累會打破這種平衡，導(dǎo)致花生葉片細(xì)胞膜過氧化，膜脂過氧化產(chǎn)物 MDA 含量增加，膜損害加劇[21]。試驗中復(fù)合菌劑處理，各時期花生葉片可溶性蛋白含量及SOD、POD活性顯著高于空白處理，而MDA含量明顯降低。說明復(fù)合菌劑的加入能有效提高花生抗氧化酶活性，增加膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。主要原因是菌劑加入使得花生抗逆性增加，更好地進行光合作用，保證花生的正常生長，進而減輕連作障礙。

復(fù)合菌劑的施用顯著增加花生的生物產(chǎn)量、莢果產(chǎn)量、百果重等，這與封海勝等[10]的研究結(jié)果相似。但施用菌劑的增產(chǎn)效果年度間差異較大，說明菌劑對花生連作障礙的緩解作用易受其它因素的影響?？赡苁怯捎诘谝荒昊ㄉ趦?nèi)雨水充足，可更好地滿足花生植株對水的要求，微生物菌劑能保證正常繁殖擴散，進而發(fā)揮其應(yīng)有的效應(yīng)。而第二年花生生育前期雨水不足，而且沒有及時補灌，導(dǎo)致土壤干旱加重，微生物菌劑較難生長繁殖，作用受限。這說明施用微生物菌劑的同時，要確保水肥條件滿足要求，為其更好地在土壤中定殖和增殖提供有利環(huán)境。

4?結(jié)論

本試驗施用菌劑處理均能有效提高花生的光合能力，以復(fù)合菌劑處理最為顯著。復(fù)合菌劑的加入能有效促進花生的光合作用，促進生物量積累，提高膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性;顯著提高花生葉片可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性，降低MDA含量;能顯著提高花生生物量和莢果產(chǎn)量，后者兩年分別達(dá)到?3 608.7kg/hm?2和3 486.4 kg/hm?2，較不施菌劑處理分別提高336.3 kg/hm?2和368.1 kg/hm?2。復(fù)合菌劑的施用能有效促進花生的生長，緩解花生連作障礙。

參?考?文?獻：

[1]孔祥麗，任新明. 花生連作障礙的產(chǎn)生機理及防控措施研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（10）：1951-1953.

[2]滕應(yīng)，任文杰，李振高，等. 花生連作障礙發(fā)生機理研究進展[J]. 土壤通報，2015，47（2）：259-265.

[3]劉娟，張俊，臧秀旺，等. 花生連作障礙與根系分泌物自毒作用的研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2015，31（30）：101-105.

[4]劉蘋，趙海軍，萬書波，等. 連作對花生根系分泌物化感作用的影響[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，19（3）：639-644.

[5]袁云云，咸洪泉，洪永聰，等.花生根系分泌物的鑒定及其化感效應(yīng)分析[J].花生學(xué)報，2011，40（3）：24-29.

[6]Shalata A，Tal M. The effect of salt stress on lipid peroxidation and antioxidants in the leaf of the cultivated tomato and its wild salt-tolerant relative Lycopersicon pennellii[J]. Physiologia Plantarum，1998，104（2）：169-174.

[7]戴傳超，謝慧，王興祥，等. 間作藥材與接種內(nèi)生真菌對連作花生土壤微生物區(qū)系及產(chǎn)量的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報，2010，30（8）：2105-2111.

[8]李鑫. 桑樹/苜蓿間作生長優(yōu)勢與土壤微生物種群多樣性研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2016.

[9]姜玉超. 玉米花生間作對土壤肥力特性的影響[D]. 洛陽：河南科技大學(xué)，2015.

[10]封海勝，張思蘇，萬書波，等. 解除花生連作障礙的對策研究 Ⅲ. 微生物調(diào)節(jié)劑的增產(chǎn)效果[J]. 花生科技，1996（3）：13-16.

[11]劉蘋，趙海軍，仲子文，等. 三種根系分泌脂肪酸對花生生長和土壤酶活性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報，2013，33（11）：3332-3339.

[12]Einhellig F A. Allelopathy：current status and future goals[C]//In：Inderjit，Dakshini K M M，Einhellig F A，eds. Allelopathy：organisms，processesand applications. ACSSymposium Series 582. Washington D C：American Chemical Society，1995：1-24.

[13]葛紅蓮，張福麗，劉志華. 復(fù)合菌劑PB12防治黃瓜疫病效果評價以及對土壤酶活性的影響[J]. 中國生物防治學(xué)報，2015，31（2）：229-235.

[14]邱敬萍，黃艷霞，王超，等. EG03菌劑對辣椒青枯病的防治效果及對根圍土壤微生物群落的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2014，25（5）：1468-1474.

[15]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[16]Schreiber U，Schliwa U，Bilger W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenchingwith a new type of modulation fluorometer[J]. Photosyn. Res.，1986，10（1/2）：51-62.

[17]Genty B，Briantais J M，Baker N R. The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence[J]. Biochim. Biophys. Acta，1989，990（1）：87-92.

[18]劉燕. 玉米花生間作體系中花生適應(yīng)弱光的光合機理[D]. 洛陽：河南科技大學(xué)，2015.

[19]唐秀梅，鐘瑞春，揭紅科，等. 間作遮蔭對花生光合作用及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，24（5）：1703-1707.

[20]焦念元，楊萌珂，寧堂原，等. 玉米花生間作和磷肥對間作花生光合特性及產(chǎn)量的影響[J]. 植物生態(tài)學(xué)報，2013，37（11）：1010-1017.

[21]竇俊輝，喻樹迅，范術(shù)麗，等. SOD與植物脅迫抗性[J]. 分子植物育種，2010，8（2）： 359-364.

[22]Zheng Y， Rinoshika A. Analysis of particle dynamics in a horizontal pneumatic conveying of the minimum pressure drop based on POD and wavelet transform[J]. Powder Technology，2017，320：726-738.

[23]Chowdhury M I， Hasan M， Islam M S. Elevated serum MDA and depleted non-enzymatic antioxidants，macro-minerals and trace elements are associated with bipolar disorder[J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology，2017，39：162-168.

[24]王旭軍，徐慶國，楊知建. 水稻葉片衰老生理的研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2005，21（3）：187-190.

[25]劉蘋，趙海軍，唐朝輝，等. 連作對不同抗性花生品種根系分泌物和土壤中化感物質(zhì)含量的影響[J]. 中國油料作物學(xué)報，2015，37（4）：467-474.

[26]尤升波，游銀偉，王翠萍，等. 復(fù)合微生物制劑對辣椒品質(zhì)及產(chǎn)量的影響[J]. 山東科學(xué)，2006，19（6）：89-90.