王守經(jīng) 杜鵬飛 王維婷 柳堯波 胡鵬 汝醫(yī) 孫蘇軍

摘要：為了解不同溫度下貯藏羊肉細菌群落結構，明確溫度條件對羊肉細菌多樣性的影響，本試驗利用高通量測序技術，分析冷藏（0±4）℃和冰溫（-1.2±1）℃貯藏條件下羊肉菌群的多樣性變化。結果表明，14個樣品共獲得優(yōu)質序列591 754條，在6個分類學水平上共獲得17 306個分類操作單元（OUT）;不同貯藏條件下，羊肉樣品細菌的豐富度和多樣性隨貯藏時間的延長均呈下降趨勢，冰溫貯藏細菌群落的改變更明顯;貯藏后期，羊肉優(yōu)勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），其中冷藏條件下分別占細菌總數(shù)的99.6%和0.4%，冰溫條件下為75.5%和24.5%。

關鍵詞：羊肉;細菌菌群;高通量測序;冷藏;冰溫貯藏

中圖分類號：S826：TS251.53文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）01-0085-06

Study on Bacterial Diversity of Mutton

under Different Storage Temperature

Wang Shoujing， Du Pengfei， Wang Weiting， Liu Yaobo， Hu Peng， Ru Yi， Sun Sujun

（Institute of Agro-Food Sciences and Technology， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong Province/Key Laboratory of

Novel Food Resources Processing， Ministry of Agriculture， Jinan 250100， China）

Abstract?In this study， high-throughput sequencing technology was applied to investigate the structures of the bacterial communities of mutton stored under different temperature conditions and determine the effects of temperature conditions on bacterial diversity. The changes in the bacterial diversity of stored mutton under conditions of （0±4）℃ （refrigerated） and （-1.2±1）℃ （ice temperature） were measured. The results showed that a total of 591 754 high-quality sequences and 17 306 classification operation units （OUT） were obtained from 14 samples at 6 taxonomic levels. The bacterial richness and diversity of mutton samples showed a downward trend with the prolongation of storage time in different storage condition， and the change of bacterial community in ice temperature storage was more obvious. Proteobacteria and Firmicutes were the dominant bacteria community in the late storage period， and they accounted for 99.6% and 0.4% respectively under cold storage conditions， and were 75.5% and 24.5% under ice temperature conditions.

Keywords?Mutton; Bacterial community; High-throughput sequencing; Cold storage; Ice temperature storage

溫度是影響微生物生長繁殖的關鍵因素之一?？刂茰囟葋硖岣咝笄萑馄焚|量和延長保質期，已成為畜禽肉類生產(chǎn)加工業(yè)的重要技術措施。目前我國肉品最普遍的產(chǎn)品形式正由冷凍肉、熱鮮肉向冷鮮肉轉換。冷鮮肉是指經(jīng)過宰后成熟的畜禽分割肉，其貯藏、運輸和銷售過程一直處于?（0±?4）℃的低溫冷鏈條件下，可以很好地保持肉的新鮮度和風味，貨架期一般可達5～7 d或更長。另一種形式的低溫肉是冰鮮肉，它是近幾年興起的一種新型食品貯藏保鮮技術。該技術把貯藏溫度控制在0℃以下到該產(chǎn)品冰點之間的范圍內，從而更高效地控制微生物生長和其他質量指標劣變，這項技術在不同食品上的應用研究已取得很大進展[1]。研究發(fā)現(xiàn)，冰鮮羊肉的貨架期可以達到20 d以上[2，3]，而控制溫度與真空包裝、復合保鮮劑處理、有機酸處理等協(xié)同技術措施相結合能夠獲得更好的肉品保鮮保質效果[4-6]。

宏基因組學技術作為一種新興的分子生物學工具，可以直接從樣品中提取微生物的總DNA，通過高通量測序分析，實現(xiàn)對微生物多樣性、種群結構、進化關系和功能性等信息的解析，既避免傳統(tǒng)方法在微生物多樣性研究中的局限性，又能夠更客觀地反映研究對象中微生物原始群落構相及動態(tài)變化過程，這項技術在許多領域已經(jīng)開展廣泛的研究工作[7-14]，但對羊肉貯藏過程中細菌多樣性的研究相對較少。本試驗對冷藏及冰溫兩種貯藏條件下細菌群落多樣性及其變化動態(tài)進行研究，旨在為冷鮮和冰鮮羊肉產(chǎn)品的質量控制提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

試驗用羊為小尾寒羊。選擇12～15月齡的去勢公羊，宰后于0～4℃條件下成熟24 h，取后腿肉作試驗樣品。

1.2?主要試劑與儀器

DNA快速提取試劑盒（Fast DNA SPIN extraction kits）購自美國MP Biomedicals公司;引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成;Illumina MiSep，美國Illumina公司產(chǎn)品;NanoDrop ND-1000 分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品;BCD-215KS型冷藏箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品;LRH-100CL低溫培養(yǎng)/貯藏箱，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3?試驗方法

1.3.1?樣品處理編號?砧板等用具于試驗前均用75%乙醇消毒，分割刀具隨時用75%乙醇消毒處理。按試驗設計要求進行樣品分割處理，剔除脂肪、筋膜后切分成5 g左右的肉塊，分別裝入無菌PE自封袋中密封，后放入冷藏（0±4）℃和冰溫（-1.2±1）℃條件下貯藏。貯藏當天取樣，冷藏樣品每隔3 d取樣一次，冰溫貯藏樣品每隔7 d取樣一次。每次取出的樣品，編號后立即放入?-70℃?超低溫冰箱中存儲，樣品編號詳見表1。

1.3.2?DNA提取?利用DNA快速提取試劑盒提取樣品細菌總DNA，運用NanoDrop ND-1000型分光光度計進行宏基因組DNA質量檢測，用瓊脂糖凝膠電泳進行純化分離，提取的DNA樣品貯藏在-20℃條件下備用。

1.3.3?16S rDNA PCR擴增?對貯藏過程中羊肉表面細菌菌落V4-V5區(qū)16S rDNA進行PCR擴增，正向引物為515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3），反向引物907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′），7 bp的樣本特異性條形碼被加入到引物中進行多重測序。PCR反應體系25 μL：5×Q5 reaction buffer 5 μL， 5×Q5 High-Fidelity GC buffer 5 μL，5 U/μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L引物2 μL，模板DNA 2 μL和?8.75μL雙蒸水。PCR反應程序：98℃熱變性?2 min?;98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán);72℃延續(xù)反應5 min。對PCR擴增產(chǎn)物進一步純化定量。

1.3.4?上機測序?定量混合好的擴增產(chǎn)物利用Illumina MiSeq測序儀測序，進行生物信息分析。本試驗的測序工作和生物信息分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4?數(shù)據(jù)分析

將測序得到的原始數(shù)據(jù)用QIIME 1.7軟件進行過濾處理，運用Mothur 1.31.2軟件進行嵌合體檢驗，去除長度≤150 bp的序列、嵌合體序列等無效序列。在97%相似性水平下劃定閾值，對有效序列劃分操作分類單元（OTU），構建稀釋曲線。

基于物種豐度的分析，應用Mothur 1.31.2軟件計算Alpha多樣性指數(shù)中的豐富度（Chaol、Ace指數(shù)）、覆蓋率（Coverage）和多樣性（Simpson、Shannon指數(shù)）。根據(jù)OUT的結果及分布，得到樣品在各個分類學水平上（門、綱、目、科、屬、種）的構成比例，進一步進行菌群結構分析。

2?結果與分析

2.1?樣品測序結果及優(yōu)質序列分布

通過對樣品細菌16S rDNA V4-V5區(qū)基因擴增，測序過程中會產(chǎn)生許多點突變等測序錯誤，為保證后續(xù)分析結果的準確性，需要按照一定的原則對獲得的有效序列進行更進一步的過濾和除去嵌合體處理，得到用于結果分析的優(yōu)質序列（表2）。14個樣品優(yōu)質序列比例均在95%以上，這說明測定結果可信度高，能夠比較準確地反映細菌菌群的豐度情況。隨著貯藏時間的增加，冷藏樣品和冰溫貯藏的序列數(shù)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，表明羊肉樣品表面菌群豐度降低，趨于簡單化。

試驗共測得優(yōu)質序列591 754條，序列長度集中分布在223～227 bp，其中數(shù)量最多的是225 bp（圖1）。本試驗測得結果的分布與所測16S rDNA的V4-V5區(qū)的條帶長度相吻合。

2.2?操作分類單元及稀釋曲線

由表3可以看出，在相似度97%條件下14個樣品細菌總的OUT數(shù)量是17 306個，在門、綱、目、科、屬、種6個分類水平上的分布，分別是?4 054、?4 035、3 855、3 130、1 838個和390個，無注釋信息的4個。

在小于5 000條序列時，A2-1、A1-1和?A-1?-2樣品的OUT數(shù)量隨樣品序列數(shù)的增加迅速上升，A、A-1-3和A-2-3樣品OUT上升速度次之，其他樣品OUT的增加速度緩慢。在?5 000～?10 000個序列范圍內，僅有A2-1樣品OUT數(shù)量增加較快，但速度較前期下降，其他樣品基本趨于平緩，此后所有樣品均趨于平緩（圖2）。說明本研究的取樣深度足夠，測序結果能夠真實地反映樣品表面的細菌群落情況。無論是冷藏還是冰溫貯藏，隨貯藏時間的延長，樣品稀釋曲線的變化更加平緩，冰溫貯藏樣品尤其明顯。

2.3?Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是指特定生態(tài)系統(tǒng)或區(qū)域內的多樣性，OUT反映了樣品細菌種類的豐富程度，而Chaol、Ace指數(shù)和Simpson、Shannon指數(shù)則表明細菌群落結構的變化情況。由表4可以看出，無論是從A至A-1-6的冷藏樣品還是A至?A-2-7?冰溫貯藏樣品，其Chaol、Ace指數(shù)和Simpson、Shannon指數(shù)的變化情況是一致的，均呈先升高后下降趨勢。從不同貯藏條件的影響來看，冷藏較冰溫貯藏樣品表面細菌群落結構更豐富。隨著貯藏期的延長，總體來看樣品細菌多樣性降低，群落結構趨于簡單。

2.4?不同貯藏條件下細菌群落結構分析

由表5可以看出，不同貯藏條件對各個分類水平細菌種類數(shù)量的影響作用不同。在（0±4）℃下，與對照A相比， A1-1、A-1-2樣品細菌種類的數(shù)量，除在屬和種水平以外，其他水平上都是增加的，而后又減少。在冰溫貯藏條件下，A2-1樣品出現(xiàn)種群數(shù)量增加，A2-2樣品則下降，而后隨貯藏時間延長，不同樣品細菌種類數(shù)量小幅上升再下降。

門分類水平上統(tǒng)計得到42個細菌類群分布（圖3），其中優(yōu)勢類群依次是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍細菌門（Cyanobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），分別占總數(shù)的76.3%、17.6%、1.5%和1.3%。在?A-1-6?樣品中Proteobacteria的比例高達?99.6%、?Firmicutes僅為0.4%，而在A-2-7樣品中Proteobacteria的比例為75.5%、Firmicutes為?24.5%。

進一步的分析結果表明，在屬分類水平上統(tǒng)計得到的細菌數(shù)量多達540個屬，其中優(yōu)勢菌群依次是莫拉氏菌屬（?Moraxellaceae?）、假單胞菌屬（?Pseudomonas?）、涅瓦均屬（?Nevskia?）、熱死環(huán)絲菌屬（?Brchothrix?）和芽孢桿菌屬（?Bacillas?），分別占總數(shù)的28.7%、25.7%、12.3%、10.4%和2.1%。從菌群分布情況看冷藏和冰溫貯藏后期的優(yōu)勢菌群非常明顯，以?Moraxellaceae?和?Pseudomonas?為主，其中A-1-6樣品?Moraxellaceae?占98.4%、?Pseudomonas?占0.4%，在A-2-7樣品中則為74.4%和0.9%，兩者的差別主要表現(xiàn)在?Brochothrix?的數(shù)量上，A-1-6樣品為0.3%，A-2-7樣品則高達24.4%，說明溫度條件對菌群結構的影響非常明顯。

3?討論與結論

江蕓等[15]研究認為，肉的腐敗很大程度上取決于初期自身假單胞菌的含量。王寧[16]研究發(fā)現(xiàn)冷卻羊肉的腐敗菌中，假單胞菌占29.25%。假單胞菌屬是一種需氧嗜冷性細菌，在低溫有氧條件下很快就發(fā)展成為優(yōu)勢菌群，冷鮮肉的腐敗絕大多數(shù)是由假單胞菌的大量繁殖引起的，在冷藏條件下貯藏末期假單胞菌數(shù)量會占到腐敗菌的90%以上。熱死環(huán)絲菌是一重要的肉類腐敗菌，具有微需氧特性，它在引起無氧包裝肉的腐敗中起到重要作用，它是一種在低溫下能夠快速繁殖的腐敗微生物，通常被認為是在冷藏條件下引起真空包裝產(chǎn)品腐敗的主要微生物[17]。本試驗得出，無論是冷藏還是冰溫貯藏，羊肉中優(yōu)勢菌群非常明顯，變形菌門的假單胞菌和厚壁菌門的熱死環(huán)絲菌占絕對優(yōu)勢，由于受不同溫度的影響，兩種細菌的比例變化較大。本試驗雖采用有氧包裝，但冰溫貯藏條件下羊肉的貯藏期更長，其原因是，隨著氧氣的消耗假單胞菌的生長繁殖受到抑制，熱死環(huán)絲菌快速生長繁殖，造成冰溫貯藏羊肉中熱死環(huán)絲菌的比例大大高于冷藏羊肉。

本試驗綜合分析可得，在冷藏和冰溫條件下，羊肉中腐敗細菌的豐度和菌群多樣性均隨貯藏時間的增加呈逐漸下降趨勢，冰溫貯藏下更加明顯;在門分類水平上，冷藏18 d時羊肉中的優(yōu)勢菌群是變形菌門（Proteobacteria，99.6%）和厚壁菌門（Firmicutes，0.4%），冰溫貯藏49 d時優(yōu)勢菌群仍然是Proteobacteria和Firmicutes，分別占75.5%和24.5%，這表明冷藏和冰溫條件對貯藏后期細菌的菌群構成產(chǎn)生了明顯影響。

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