滿衛(wèi)萍 張志剛 李春民 趙智中 王榮花 劉栓桃 李巧云 王立華

摘要：為篩選與目的基因連鎖更加準(zhǔn)確的分子標(biāo)記以及明確分子標(biāo)記鑒定技術(shù)的準(zhǔn)確率，同時為后期進行基因精細定位研究提供技術(shù)手段，本試驗采用F?2∶3?家系進行F2單株的TuMV抗性鑒定。結(jié)果表明，122個大白菜抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291 的 F?2∶3?家系中，抗病的有98個，感病的有24個，經(jīng)卡方測驗，符合3∶1的分離比例，與以往對該群體F2代TuMV抗性分離比例的研究一致，表明這種鑒定方法可行。本結(jié)果可為今后分離群體單株TuMV抗性的準(zhǔn)確鑒定提供參考。

關(guān)鍵詞：大白菜;F?2∶3?家系; TuMV;單株抗性

中圖分類號：S634.1文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）01-0115-04

Identification of Single Plant Resistance to TuMV in Segregated

Population of Chinese Cabbage by F?2∶3Family Method

Man Weiping?Zhang Zhigang2*?， Li Chunmin?3， Zhao Zhizhong?2，

Wang Ronghua?2， Liu Shuantao?2， Li Qiaoyun?Wang Lihua?2

（1.College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China;

2. Vegetables and Flowers Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Branch of National Center

for Vegetables Improvement/Shandong Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables， Jinan 250100， China;

3.Penglai Daliuhang Comprehensive Agricultural Service Station， Penglai 265615， China）

Abstract?In order to screen out molecular markers with more accurate linkage distance and make clear of the identification accuracy of molecular markers， as well as for fine gene mapping in the later period， the F?2∶3families were used to identify the TuMV resistance of F2 single plant. The results showed that in 122 Chinese cabbage F?2∶3families with their resistant parent ‘8407 and susceptible parent ‘Guan 291， 98 were resistant families and 24 were susceptible families，which was in accordance with the 3∶1 separation ratio byChi-?square test. This was consistent with previous studies in segregation ratio of TuMV resistance in F2 generation， which indicated that this method was feasible. This study provided a methodological guide for accurate identification of individual isolate on TuMV resistance in the future.

Keywords?Chinese cabbage;F?2∶3Families;TuMV;Single plant resistance

利用分子標(biāo)記和性狀遺傳分析對F?2?分離群體單株相關(guān)性狀進行抗性鑒定并保證鑒定的準(zhǔn)確性非常重要。但此類鑒定常常由于環(huán)境和操作方法等原因，難以得到準(zhǔn)確結(jié)果。目前，為獲得準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，科研中較為常用的鑒定方式是構(gòu)建F?2∶3?家系研究某一F?2?單株的F?2∶3?家系的性狀表現(xiàn)。

利用F?2∶3?家系開展性狀鑒定的研究已有報道。魏蒙關(guān)[1]利用F?2∶3?家系對13個玉米秸稈產(chǎn)量和品質(zhì)性狀進行單個性狀的QTL定位和效應(yīng)分析。余學(xué)杰等[2]利用 F?2∶3?群體分析玉米的穗長、禿尖長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、粒深、百粒重、出籽率和單株生產(chǎn)力等 9 個性狀的變異及其相關(guān)性。李清超等[3]利用F?2∶3?群體對玉米株型性狀進行研究，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對影響玉米葉向值的主要株型性狀進行分析。周坤華等[4]利用辣椒種間F?2∶3?群體進行主要農(nóng)藝性狀 QTL 分析，株高、主莖高、果長、果徑、單果質(zhì)量、果形和果實辣味等7個性狀的9 個加性 QTL 在兩個群體中同時被檢出。魏良明等[5]利用 F?2∶3?家系對玉米淀粉含量的表現(xiàn)及其與單株產(chǎn)量、百粒重、穗長、穗粗、穗行數(shù)等的相關(guān)性進行了研究。在抗病性鑒定方面，蔣思霞等[6]利用 F?2∶3?家系進行黃曲霉菌抗性鑒定的研究。錢偉[7]在對大白菜TuMV抗性基因retr02進行定位和克隆研究時，也采用F?2∶3?家系輔助F?2?群體單株的TuMV抗性鑒定。李巧云等[8]在研究大白菜抗TuMV分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)時，也引入F?2∶3?家系鑒定，以獲得更準(zhǔn)確的原 F?2?單株的TuMV抗性及基因型。目前，尚未見關(guān)于利用 F?2∶3?家系鑒定大白菜TuMV分離群體單株抗性具體方法的報道。

本研究通過構(gòu)建大白菜抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291 的 F?2∶3?家系，對每個 F?2∶3?家系的TuMV抗性進行鑒定，進而判斷原 F?2?代單株的TuMV抗性，推測其基因型，并結(jié)合以往關(guān)于原F?2?群體的分離比例的研究，進一步驗證這種鑒定方法的準(zhǔn)確性。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

供試抗病親本材料為大白菜TuMV國家級抗源材料8407（P1），感病親本材料為高感TuMV的核心種質(zhì)材料冠291（P2），兩親本雜交得F?1?群體，F(xiàn)?1?自交后構(gòu)建F?2?代分離群體，F(xiàn)?2?代單株自交構(gòu)建F?2∶3?家系。

供試TuMV的C4株系引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。

1.2?試驗方法

對28株抗病親本8407（P1）、29株感病親本冠291（P2）、30株F?1?和288株F?2?群體分別采用摩擦接種?[9]和剝?nèi)~接種相結(jié)合的方法接種TuMV的C4株系，共剝?nèi)~接種2次，具體參見文獻[10]的方法。接種3周后進行TuMV抗性調(diào)查，共調(diào)查3次，分別間隔1周。

對F?2?代122個單株自交構(gòu)建F?2∶3?家系，每個F?2∶3?家系的10株以上單株接種TuMV的C4株系，采用生物學(xué)觀察方法對F?2∶3?家系的TuMV抗性進行鑒定。

1.3?抗病性鑒定

病情分級、病情指數(shù)計算和抗性歸類標(biāo)準(zhǔn)參見張曉亮[11]的方法和GB/T 19557.5-2004[12]。具體分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級：無任何癥狀;

0.1級：接種葉出現(xiàn)個別褪綠斑;

0.5級：接種葉出現(xiàn)少數(shù)褪綠斑;

1級：心葉明脈，輕花葉;

3級：心葉及中部葉片花葉或心葉皺縮成畸形;

5級：心葉及中、外部葉片花葉，少數(shù)病葉畸形、皺縮，植株輕度矮化;

7級：重花葉，多數(shù)病葉畸形、皺縮，球葉上出現(xiàn)壞死斑及葉脈輕度壞死，植株矮化;

9級：植株表現(xiàn)嚴(yán)重花葉和皺縮，多數(shù)葉片畸形，葉脈壞死至整株壞死，無商品價值。

R：0<DS≤1;

MR：1<DS≤3;

MS：3<DS≤5;

S：5<DS≤9。

其中，R表示抗病，MR表示中抗，MS表示中感，S表示感病，DS表示病級，下同。

根據(jù)調(diào)查結(jié)果，計算群體的病情指數(shù)：

病情指數(shù)=Σ （病級的代表值×該病發(fā)病株數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）×100?。

高抗（HR）：病情指數(shù)0.01～11.11;

抗?。≧）：病情指數(shù)11.12～33.33;

耐?。═）：病情指數(shù)33.34～55.55;

感病（S）：病情指數(shù)55.56～77.77;

高感（HS）：病情指數(shù)77.78～100。

2?結(jié)果與分析

2.1?P1、P2、F?1?及F?2?代群體TuMV抗性分析

由表1可知，抗病親本（P1）各單株病級均在1級以下，其中以0級最多，病情指數(shù)為1.43，屬于高抗;感病親本（P2）各單株病級均在5級以上，其中以7級最多，病情指數(shù)為77.78，屬于高感;F?1?群體各單株病級均在3級以下，其中以1級最多，病情指數(shù)為11.22，屬于抗病;F?2?群體出現(xiàn)抗、感分離，符合3∶1的分離比例（χ?2?c?=1.50<χ?2?0.05?=3.84）。進一步表明本研究中的TuMV抗性受顯性單基因控制。

2.2?F?2∶3?家系TuMV抗性分析

由表2可以看出，根據(jù)122個F?2∶3?家系的病情指數(shù)推測原F?2?單株的TuMV抗性，結(jié)果為：高抗（HR）48株，抗病（R）33株，耐?。═）17株，感病（S）21株，高感（HS）3株;抗、感單株比為98∶24，符合3∶1的分離比例（χ?2c=1.85<χ?2?0.05?=3.84）。

根據(jù)抗病性鑒定特點，抗病株系中沒有出現(xiàn)感病單株，表明其抗性是純合的（參考病情指數(shù)為?0.01～?2.00），基因型記為AA;抗病株系中出現(xiàn)感病單株，表明其抗性不是純合的（參考病情指數(shù)為?2.01～?55.55），基因型記為Aa;感病株系在接種時，由于接種手法、環(huán)境等因素的影響，不能保證所有單株都發(fā)病，因此，病情指數(shù)55.56～100的全部歸為純合感病，基因型記為aa。

由表3看出，122個F?2?單株中，基因型為AA的有30株，基因型為Aa的有68株，基因型為aa的有24株。基因型AA∶Aa∶aa的比例為30∶68∶24，符合1∶2∶1的分離比例（χ?2c=2.20<χ?2?0.05?=?5.99）。

3?討論與結(jié)論

在分子標(biāo)記與基因定位研究中，表型鑒定的準(zhǔn)確性直接影響到分子標(biāo)記的遺傳距離計算和基因定位的準(zhǔn)確性。因此，研究更加準(zhǔn)確的分離群體單株性狀鑒定方法尤為重要。

本研究利用抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291為親本，構(gòu)建122個F?2∶3?家系，通過對這些家系進行TuMV接種和鑒定，判斷原F?2?單株的TuMV抗性。結(jié)果表明，抗病株系有98個，感病株系有24個，經(jīng)卡方測驗，符合3∶1的分離比例。這一結(jié)果與以往對該群體F?2?代TuMV抗性分離比例的研究結(jié)果一致[11]，表明這種鑒定方法可用于大白菜TuMV抗性單株鑒定。相對于F?2?代單株接種鑒定方法，此方法根據(jù)F?2∶3?家系的病情指數(shù)來判斷原F?2?單株的抗性，準(zhǔn)確性更高。

本課題組在2009年發(fā)表過一篇關(guān)于ELISA方法鑒定分離群體單株抗性的研究[9]。但該方法仍未能排除接種手法和環(huán)境對單株抗性的影響。相比較而言F?2：3?家系的性狀表現(xiàn)整體情況更能反映原F?2?單株的真實性狀特點。在大白菜分子標(biāo)記輔助選擇方面，錢偉[7]采用了F?2∶3?家系輔助F?2?群體單株的TuMV抗性鑒定，用于大白菜TuMV抗性基因retr02的精細定位研究，獲得準(zhǔn)確的精細定位結(jié)果，并進行了相關(guān)基因的克隆。本課題組[8]在研究大白菜抗TuMV分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)時，也引入F?2∶3?家系鑒定，獲得了較為準(zhǔn)確的標(biāo)記選擇準(zhǔn)確率。本研究所得利用F?2∶3?家系輔助F?2?群體進行TuMV抗性鑒定的方法可為今后更好地從事相關(guān)方面的研究提供參考。

參?考?文?獻：

[1]魏蒙關(guān).玉米兩個相關(guān)F?2∶3?群體秸稈產(chǎn)量和品質(zhì)性狀QTL分析及遺傳相關(guān)研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[2]余學(xué)杰，石海春，柯永培，等. 一個玉米F?2∶3?群體主要性狀的變異及相關(guān)分析[J]. 玉米科學(xué)，2008 ，16（3）： 22-25.

[3]李清超，馬浪浪，文瓊，等. 基于玉米F?2∶3?群體株型性狀的灰色關(guān)聯(lián)度分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，42（21）：6-10.

[4]周坤華，雷剛，方榮，等. 利用辣椒種間 F?2和F?2∶3?兩個群體進行其主要農(nóng)藝性狀 QTL 分析[J]. 園藝學(xué)報，2015，42（5）：879-889.

[5]魏良明，王延召，宋迎輝，等. 玉米F?2∶3?群體淀粉含量的表現(xiàn)及相關(guān)性分析[J]. 種業(yè)導(dǎo)刊，2016（12）：15-17.

[6]蔣思霞，陳堅劍，徐志英，等. 玉米自交系和F?2∶3?家系對黃曲霉菌抗性的鑒定[J]. 揚州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2012，33（2）：45-50.

[7]錢偉.大白菜TuMV抗性基因retr02的克隆與抗性機制研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[8]李巧云，張志剛，趙智中，等. 大白菜抗TuMV分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，49（2）： 10-14.

[9]李巧云，張志剛，成文華，等.利用ELISA方法鑒定大白菜TuMV抗性[J].科技導(dǎo)報，2009，27（1）：42-45.

[10]高會超，曾強，張志剛，等. 與大白菜TuMV抗病基因TuRBCS01緊密連鎖的分子標(biāo)記開發(fā)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2016， 24（2）： 196-205.

[11]張曉亮.大白菜抗蕪菁花葉病毒（TuMV）基因分子標(biāo)記篩選與定位[D].青島：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[12]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 大白菜：GB/T 19557.5—2004 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.