李聞新，張 余，部 實(shí)，張福林

0 引言

磺丁基醚-β-環(huán)糊精(Betadex sulfobutyl ether sodium，SBE-β-CD)是20世紀(jì)90年代由美國(guó)Cydex 公司開(kāi)發(fā)成功的β-環(huán)糊精(β-CD)衍生物[1]，能與藥物分子包合形成非共價(jià)復(fù)合物[2]，提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性。與β-CD相比，SBE-β-CD具有水溶性好、腎毒性低、溶血作用小等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于藥物新包合物的研究[3-7]。SBE-β-CD是由1,4-丁烷磺內(nèi)酯與β-CD發(fā)生取代反應(yīng)得到的，由其合成工藝可知，β-CD是制備原料之一，所以控制SBE-β-CD中β-CD的含量是其質(zhì)量控制的重要因素。目前僅一項(xiàng)研究報(bào)道了SBE-β-CD中β-CD的含量測(cè)定方法[8]。該方法采用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器，分析時(shí)間近30 min。本研究采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，并優(yōu)化色譜條件，將分析時(shí)間縮短至10 min內(nèi)，明顯提高了分析效率，建立了β-CD含量測(cè)定方法。該方法靈敏準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快捷，為SBE-β-CD質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2420 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(沃特世科技有限公司)。

1.2 試藥β-CD對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度>98%，批號(hào)：100317-201203)，SBE-β-CD供試品 (批次：20131104、20131105、20131106，由我院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；甲醇為色譜純(SK chemicals)；水為超純水。

1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(10∶90)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；ELSD參數(shù)：漂移管溫度為70 ℃，氣體(N2)壓力為30 psi，進(jìn)樣量為10 μl。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品溶液 精密稱取β-CD對(duì)照品23.47 mg，用水溶解，定容到100 ml量瓶中，得濃度為0.234 7 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 供試品溶液 精密稱取樣品約385 mg，用水溶解，定容到25 ml量瓶中，得濃度約為15 mg/ml的樣品溶液。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 專屬性試驗(yàn) 分別取“1.4”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液、二者的混合溶液和空白溶劑，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。

1.5.2 線性和范圍 精密量取對(duì)照品溶液適量置10 ml量瓶中，逐級(jí)稀釋得濃度為0.078 23、0.117 4、0.156 5、0.195 6、0.234 7 mg/ml的系列溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)β-CD濃度(C)進(jìn)行線性回歸。

將對(duì)照品溶液逐步稀釋并進(jìn)行測(cè)定，以信噪比S/N=10和S/N=3時(shí)各對(duì)照品的量為定量限和檢測(cè)限。

1.5.3 精密度和重復(fù)性 于SBE-β-CD溶液中加入適量β-CD對(duì)照品，平行制備5份，測(cè)定含量，計(jì)算RSD，考察方法的精密度。精密吸取β-CD對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算β-CD峰面積的RSD，考察儀器重復(fù)性。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取β-CD標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別在0、4、8、12 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD，考察其穩(wěn)定性。

1.5.5 回收率試驗(yàn) 于SBE-β-CD溶液中加入適量β-CD對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法，平行制備6份，測(cè)定β-CD含量并計(jì)算回收率。回收率按如下公式計(jì)算：(測(cè)得量-樣品中含量)/加入量×100%。

1.6 供試品含量測(cè)定 取3批SBE-β-CD供試品，按“1.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖和峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品的含量。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性 β-CD和SBE-β-CD的保留時(shí)間分別為9.512 min和2.013 min，所用試劑及SBE-β-CD供試品對(duì)β-CD的測(cè)定均無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。

2.1.2 線性和范圍 β-CD在0.078 23～0.234 7 mg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程：Y=1.674 7 X+3.593 2，r=0.994 7。β-CD的定量限和檢測(cè)限分別為0.078 23、0.045 40 mg/ml。

2.1.3 精密度和重復(fù)性 β-CD精密度的RSD為3.4%，表明該方法精密度良好。見(jiàn)表1。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果RSD為4.6%，見(jiàn)表2。

2.1.4 穩(wěn)定性 β-CD在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)濃度的RSD為2.4%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見(jiàn)表3。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

圖1 專屬性色譜圖

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 回收率 β-CD的平均回收率為105.8%，RSD為4.8%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表4。

表4 回收率測(cè)定結(jié)果

2.2 含量測(cè)定 3批次SBE-β-CD供試品中均未檢測(cè)到雜質(zhì)β-CD。

3 討論

3.1 檢測(cè)器的選擇及參數(shù)的優(yōu)化 由于β-CD及其衍生物SBE-β-CD是一類環(huán)狀低聚糖，在紫外區(qū)域內(nèi)沒(méi)有吸收，所以無(wú)法用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，只能使用通用型檢測(cè)器。有文獻(xiàn)報(bào)道，用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)β-CD，也能達(dá)到比較高的靈敏度[8]，但該方法分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30 min，嚴(yán)重影響檢測(cè)效率。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)作為一種通用型質(zhì)量檢測(cè)器，其針對(duì)糖類的檢測(cè)已經(jīng)有不少報(bào)道[9-10]，但對(duì)β-CD的檢測(cè)國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)優(yōu)化色譜條件，在提高分析效率的同時(shí)取得了較理想的分離效果。

漂移管溫度和載氣壓力是ELSD的2個(gè)重要參數(shù)[11]，漂移管溫度影響檢測(cè)器的響應(yīng)，溫度升高，流動(dòng)相蒸發(fā)趨于完全，信噪比上升，但溫度過(guò)高，可能導(dǎo)致分析物部分氣化，信號(hào)強(qiáng)度變小，霧化載氣流速影響霧化器中液滴的形成，從而影響到檢測(cè)器的響應(yīng)，信噪比隨流速的增加而升高，由于本實(shí)驗(yàn)使用的是低溫型ELSD，所以漂移管溫度設(shè)為70 ℃即可使流動(dòng)相完全蒸發(fā)，達(dá)到理想的分離效果。ELSD的響應(yīng)取決于被分析物顆粒的數(shù)量和大小，在ELSD載氣的壓力對(duì)信號(hào)的影響很大。載氣壓力太低會(huì)形成大量的微粒，從而導(dǎo)致尖峰信號(hào)或噪聲信號(hào)。當(dāng)載氣壓力太高時(shí)，微粒量會(huì)下降，導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度降低，本實(shí)驗(yàn)使用N2作為載氣，最終氣體壓力定為30 psi，此時(shí)可達(dá)到最小的噪聲信號(hào)，色譜圖基線平穩(wěn)。

3.2 流動(dòng)相比例的優(yōu)化 由于相關(guān)文獻(xiàn)較少，本研究借鑒了低聚糖的色譜條件[12-13]，并結(jié)合專屬性試驗(yàn)進(jìn)行了色譜條件的優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)在40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%范圍內(nèi)考察不同比例的甲醇水溶液作為流動(dòng)相的情況，結(jié)果顯示，甲醇在流動(dòng)相中比例增大可有效改善峰形，有利于組分的基線分離，但甲醇比例增加不利于SBE-β-CD和β-CD的溶解，β-CD保留時(shí)間也明顯縮短，最終使SBE-β-CD和β-CD分離度降低。當(dāng)增加流動(dòng)相中水的比例時(shí)，有利于組分的分離，但水的比例過(guò)大，不利于流動(dòng)相在漂移管內(nèi)的氣化，使基線噪聲增大，從而導(dǎo)致分析靈敏度降低，綜合考慮分離效果、分析時(shí)間等因素，選擇甲醇-水(10∶90，v/v)二元混合流動(dòng)相。

3.3 結(jié)論 本研究建立的HPLC-ELSD方法能準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)SBE-β-CD中β-CD的含量，且該方法簡(jiǎn)單易行、專屬性強(qiáng)，可用于SBE-β-CD質(zhì)量控制的研究。