李 菡， 雷 婷， 毛跟年， 孔 陽， 趙倩倩， 夏 娟

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液疾病研究室， 廣東 湛江 524001)

0 引言

藥材經(jīng)炮制后使用是臨床上中藥使用的特色體現(xiàn)，通過炮制改變了藥物的藥性及活性成分的含量，產(chǎn)生新的臨床療效和生物活性[1].大黃，臨床使用歷史久遠(yuǎn)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，能攻下積滯、通腑泄熱、清熱解毒、通經(jīng)止血等.現(xiàn)代研究證實(shí)，大黃及其活性成分可廣泛用于保肝利膽、抑菌消炎、降血脂，抗氧化抗腫瘤等[2].大黃也是著名的“生熟異治”臨床使用中藥，最早在東漢張仲景所著的《金匱玉函經(jīng)》就提出“……皆去黑皮、或炮或生……”的生熟大黃概念.臨床使用中，生大黃常用于攻積導(dǎo)滯、通瀉熱毒，酒蒸后的熟大黃毒性作用降低，常用于活血化瘀[3].

在現(xiàn)代資料研究中，多比較生大黃與熟大黃的化學(xué)成分或?yàn)a下、解熱、抗炎等作用，如隋峰等[4]提出生大黃比熟大黃的解熱作用更顯著，Wang等[5]通過超高效液相色譜聯(lián)合離子阱—飛行時(shí)間質(zhì)譜分析方法(UFLC/MS-IT-TOF)比較不同炮制品大黃中化學(xué)成分變化，證實(shí)與生大黃相比，熟大黃通過水蒸減少了蒽醌苷含量而消弱了瀉下作用.在大鼠熱結(jié)血瘀模型中，熟大黃相較于生大黃顯示出更顯著的藥效作用[6].臨床上已有將大黃運(yùn)用于治療應(yīng)激性胃黏膜病變，但對(duì)于兩種炮制品大黃對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍的作用比較未見相關(guān)研究.

嚴(yán)重性應(yīng)激易誘發(fā)胃腸粘膜損傷，出現(xiàn)出血、潰瘍、穿孔等癥狀，其主要原因與胃酸分泌過多、黏膜內(nèi)血流量減少和防御機(jī)能減弱有關(guān)[7].有研究發(fā)現(xiàn)，大黃作用于重癥患者并發(fā)消化道出血時(shí)，具有保護(hù)胃腸黏膜的作用[8]，對(duì)腦損傷病人誘發(fā)的應(yīng)激性胃腸道出血、消化道粘膜病變有明顯治療作用，但具體機(jī)制未知.中華古方大柴胡湯是中醫(yī)藥領(lǐng)域防止應(yīng)激性胃潰瘍的經(jīng)典方劑之一，其中大黃藥效明顯[9].大黃提取液能降低運(yùn)動(dòng)應(yīng)激性胃潰瘍大鼠的潰瘍指數(shù)，作用機(jī)制可能與促進(jìn)前列環(huán)素(PGI2)的合成和釋放，減輕縮血管作用有關(guān)[10].

為比較生熟大黃對(duì)胃潰瘍的作用情況及初步解析其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同劑量生大黃與熟大黃對(duì)水浸束縛應(yīng)激法導(dǎo)致的應(yīng)激性胃潰瘍小鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)、胃酸pH及血漿中丙二醛( malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶( superoxide dismutase,SOD)、一氧化氮(nitrogen,NO)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1 ,ET-1)的影響，初步考察不同炮制品大黃對(duì)應(yīng)激引起的胃潰瘍的治療作用及治療機(jī)制，為更優(yōu)的發(fā)揮不同炮制品療效，規(guī)范臨床使用提供理論數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性昆明小鼠,體重18～20 g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào) SCXK( 陜)2013-0004.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于室溫(20±2)℃ ，相對(duì)濕度50%～60%的環(huán)境中，每籠6只，自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境5天后開始實(shí)驗(yàn).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

(1) 藥品：大黃購于西安市中醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)陜西科技大學(xué)藥學(xué)系毛跟年教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.的干燥根及根莖，符合2015年版《中國藥典》規(guī)定.所用生大黃炮制工藝： 刮去外皮，切厚片或塊，60℃烘干. 熟大黃的炮制工藝[3]：生大黃切片，黃酒拌勻后悶3 h至潤透，等黃酒被完全吸收，放入高壓蒸鍋內(nèi)120 ℃蒸5 h至內(nèi)外均為焦黑色，晾干待用.奧美拉唑腸溶膠囊(北京悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)14351155).

(2) 試劑：黃酒(浙江紹興鑒湖釀酒有限公司，批號(hào)20161225，酒精度≥14%)，BCA蛋白定量試劑盒，超氧化物歧化酶 ( SOD)測(cè)試盒，一氧化氮(NO)測(cè)試盒，丙二醛(MDA)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20160928,20170502,20170429,20170424).小鼠內(nèi)皮素-1( ET-1)Elisa試劑盒(尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)20170513)，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為市售分析純.

1.1.3 儀器

YP802N型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司) ，YF-111B型高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司),LMQ.C-50E型新華醫(yī)療全自動(dòng)高壓滅菌鍋(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司),varioskan flash型全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(芬蘭Thermo Scientific科技有限公司)，PHS-3C型精密pH計(jì)(深圳市同奧科技有限公司) ，TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司) ，DM2500M型正置顯微鏡(德國徠卡Leica儀器有限公司)，IKARV 10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司).

1.2 方法

1.2.1 生大黃與熟大黃水提物制備

分別將生大黃與熟大黃粉碎為粗粉，用10倍水浸泡2 h，煎煮2次，每次10 min，過濾，合并濾液.用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃，0.083 MPa 減壓濃縮成浸膏，滅菌，制成含生藥1 g·mL-1，即得生大黃與熟大黃水提藥液(生大黃浸膏含大黃素0.102 mg·g-1，熟大黃水提物含大黃素0.116 mg·g-1)，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

臨床用大黃以3～15 g·d-1的使用劑量，按人與小鼠體表面積體重比換算選取用藥劑量0.78 g·kg-1和3.12 g·kg-1.

1.2.2 小鼠急性胃潰瘍模型建立

治療組灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天，正常及模型對(duì)照組均灌服水溶液.第7天灌胃后，將小鼠給水不給食24 h. 第8天，將模型組及治療組小鼠捆綁束縛浸入恒溫水浴箱中，液面到小鼠劍突下，水溫調(diào)節(jié)在(20±2) ℃，浸泡15 h后，取材檢測(cè).

1.2.3 動(dòng)物分組與給藥

(20±2) g小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，隨機(jī)分成7組，每組8只，分別為正常對(duì)照組(NC)、模型組(MO)、陽性藥奧美拉唑組(20.0 mg·kg-1,AO)、生大黃低劑量組(7.8 g·kg-1,RL)，生大黃高劑量組(15.6 g·kg-1,RH)，熟大黃低劑量組(7.8 g·kg-1,SL)， 熟大黃高劑量組(15.6 g·kg-1,SH)，給藥劑量為10 mL·kg-1.

1.2.4 胃潰瘍相關(guān)指數(shù)檢測(cè)

剖取全胃組織，沿胃大彎處剪一小口，小心擠出胃內(nèi)容物于離心管中，收集胃液，稱量體積，用上清液測(cè)定 pH值.

取胃組織，沿胃大彎剪開，去除食糜，冰生理鹽水緩慢沖洗胃內(nèi)容物，潰瘍指數(shù)( Ulcer index，UI)用游標(biāo)卡尺測(cè)定，首先觀察潰瘍?cè)顐€(gè)數(shù)，然后分別測(cè)出潰瘍的長徑和寬徑，將兩者相乘求其總和作為UI.

潰瘍抑制百分率計(jì)算公式為:

潰瘍抑制百分率(%)=(模型組胃潰瘍指數(shù)-給藥組胃潰瘍指數(shù)) /模型組胃潰瘍指數(shù)×100%.

取各組動(dòng)物胃組織相同位置，中性福爾馬林固定48 h，石蠟包埋切片，厚度統(tǒng)一為4μm ，經(jīng)脫蠟，蘇木精-伊紅(HE) 染色，光學(xué)顯微鏡觀察組織學(xué)變化.

1.2.5 血清指標(biāo)檢測(cè)

摘眼球取血，血液4 ℃冰箱靜置1 h，4℃ 3 500 r·min-1離心10 min，收集上清液保存于-20 ℃冰箱備用.按試劑盒介紹的方法測(cè)定血液中ET-1、 MDA 、NO含量和SOD活性.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示.組間差異比較用ANOVA比較t檢驗(yàn)分析，由 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成.P< 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 生大黃與熟大黃對(duì)小鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)(UI)及潰瘍抑制率影響

對(duì)束縛-水浸法所致應(yīng)激性胃潰瘍小鼠的胃組織肉眼觀察,與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠多處有大小不等的出血點(diǎn)，集中于腺胃部,邊界清晰,無穿孔發(fā)生，潰瘍指數(shù)顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，生大黃高劑量組潰瘍指數(shù)降低(P<0.05)，熟大黃高劑量組和陽性藥組潰瘍指數(shù)明顯降低(P<0.01).如表1所示，生大黃與熟大黃均對(duì)應(yīng)急性胃潰瘍小鼠的潰瘍有抑制作用，相同劑量下，熟大黃的作用更顯著.

表1 生大黃與熟大黃對(duì)小鼠急性胃潰瘍潰瘍 指數(shù)的影響(x±s，n=6)

注：與正常組比較，▲▲P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 生大黃與熟大黃對(duì)小鼠胃黏膜組織形態(tài)學(xué)的影響

組織病理學(xué)結(jié)果表明，正常對(duì)照組：胃黏膜層光滑完整，上皮細(xì)胞排列整齊，未見毛血管擴(kuò)張充血和炎性細(xì)胞浸潤. 模型對(duì)照組: 胃黏膜上皮明顯破損，局部腺體結(jié)構(gòu)紊亂，腺腔內(nèi)有較多脫落的上皮細(xì)胞碎片和炎癥細(xì)胞浸潤，部分壁細(xì)胞腫大. 生大黃低劑量組：胃黏膜上皮破損較嚴(yán)重，腺腔內(nèi)偶見脫落細(xì)胞，潰瘍破壞黏膜下層，并有炎癥細(xì)胞浸潤. 生大黃高劑量組: 胃黏膜輕度缺損，腺體排布整齊，有少部分炎癥浸潤.損傷較模型組明顯減輕，腺體排列較整齊.熟大黃低劑量組: 胃粘膜輕度缺損，腺體排列較整齊，有少部分炎癥細(xì)胞浸潤. 熟大黃高劑量組:胃黏膜保持完整性，腺體排列較整齊，受損部位表淺且范圍較小，偶見表層小片狀脫落上皮，浸潤炎細(xì)胞較少(見圖1). 從病理結(jié)果看生大黃與熟大黃對(duì)小鼠胃黏膜損傷和炎癥細(xì)胞浸潤均有不同程度的緩解.

(a)正常對(duì)照組 (b)模型對(duì)照組 (c)生大黃低劑量組

(d)生大黃高劑量組 (e)熟大黃低劑量組 (f)熟大黃高劑量組

(g)陽性藥組圖1 生大黃與熟大黃對(duì)小鼠胃黏膜組織 病理變化的影響(HE，×200)

2.3 生大黃與熟大黃對(duì)小鼠胃液量及胃液pH的影響

胃酸是導(dǎo)致胃黏膜損傷的主要因素之一[11]，研究證實(shí)，阻斷胃酸分泌的實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠和臨床胃潰瘍病人，潰瘍愈合率均較高[9].因此本研究測(cè)定了生大黃與熟大黃高、低劑量組對(duì)急性胃潰瘍小鼠胃酸量、胃酸pH的影響，如圖2所示.與正常對(duì)照組相比，模型組胃液量相對(duì)增加,胃液pH明顯降低(P<0.05).與模型組相比，生大黃高劑量組、熟大黃低劑量組和熟大黃高劑量組能顯著增加胃液pH(P<0.05)，證實(shí)給予生大黃與熟大黃均能顯著改善急性胃潰瘍小鼠胃液過酸的癥狀，起到保護(hù)作用，與臨床觀察到的大黃顯著提高胃腸功能衰竭患者胃腸粘膜組織的pH值，保護(hù)胃腸黏膜相一致[5].相同劑量下，熟大黃的保護(hù)作用更明顯.

(a)胃液體積

(b)胃液pH圖2 生大黃與熟大黃對(duì)小鼠胃液量和胃酸pH 的影響((x±s，n=6);*P<0.05;#P<0.05)

2.4 生大黃與熟大黃對(duì)急性胃潰瘍藥效作用機(jī)制分析

氧自由基介入了絕大部分致潰瘍因子的損傷過程，可能與脂質(zhì)過氧化損害及共價(jià)鍵結(jié)合性損傷有關(guān)[12].胃粘膜攻擊因子之一的MDA和胃粘膜保護(hù)因子之一的SOD的表達(dá)情況指示了組織中清除氧自由基的能力或受自由基損傷程度的平衡偏移情況.本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了生大黃和熟大黃不同劑量組對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍小鼠血清中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD及MDA表達(dá)的影響，結(jié)果如圖3所示.對(duì)比正常對(duì)照組，應(yīng)激性胃潰瘍小鼠血清中SOD水平明顯升高，MDA水平明顯降低.給予作用藥物后，對(duì)比模型對(duì)照組，熟大黃高劑量組血清中SOD水平明顯升高(均P<0.05)，熟大黃高劑量組血清中MDA水平明顯降低(P<0.05),表明生大黃與熟大黃治療急性胃潰瘍的機(jī)制可能是通過降低氧自由基的反應(yīng)而抑制胃潰瘍的產(chǎn)生和促進(jìn)潰瘍愈合.

NO是一種內(nèi)源性血管舒張因子，可促進(jìn)胃、小腸黏膜的血管擴(kuò)張，改變血管通透性，對(duì)維持上皮完整性和微血管屏障功能有重要作用[13].ET-1是一種已知的、最強(qiáng)的內(nèi)源性血管收縮因子，可以通過作用于靶細(xì)胞上特異性受體，升高細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度，起到強(qiáng)烈收縮血管的作用[14].作為主要的血管收縮因子和舒張因子，兩者表達(dá)的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)調(diào)節(jié)血管張力、維持黏膜局部血流量具有關(guān)鍵性作用.如圖3所知，應(yīng)激性胃潰瘍小鼠血清中ET-1水平明顯升高，NO水平明顯降低.而熟大黃高劑量組NO水平明顯升高(均P<0.05)，生大黃高劑量組和熟大黃低劑量及高劑量組血清中ET-1水平明顯降低(均P<0.05).表明大黃可通過增加胃粘膜血流改善胃黏膜受損狀態(tài)，而發(fā)揮抗?jié)冏饔?，結(jié)果與臨床報(bào)道的給予危重病患者大黃預(yù)防性治療后，應(yīng)激性胃腸粘膜病變拌出血發(fā)生率明顯降低相一致[11].對(duì)比同等劑量的生大黃組，熟大黃組變化趨勢(shì)更明顯,表明熟大黃治療的小鼠胃黏膜受損改善狀態(tài)要好于生大黃組.

(a)SOD

(b)MDA

(c)NO

(d)ET-1圖3 生大黃與熟大黃對(duì)急性胃潰瘍模型小鼠 血液中SOD、MDA、NO和ET-1的影響 ((x±s，n=6);*P<0.05,**P<0.01; #P<0.05,##P<0.05)

3 結(jié)論

綜上所述，生大黃與熟大黃能通過升高抗氧化因子SOD活性和NO水平，降低脂質(zhì)過氧化物MDA及損傷因子ET-1表達(dá)，促進(jìn)氧自由基清除，抑制胃酸分泌，加速潰瘍愈合，從而保護(hù)受損的胃黏膜組織.相同劑量下，熟大黃對(duì)應(yīng)急性胃潰瘍小鼠血漿中SOD、MDA、NO和ET-1的影響更顯著，加之有研究證實(shí)炮制得到的熟大黃減弱了大黃的毒性[15]，因此熟大黃在胃潰瘍疾病中具有更高的治療價(jià)值.本研究著眼于臨床常見病癥應(yīng)激性胃潰瘍，對(duì)生熟大黃的藥效作用及作用機(jī)制進(jìn)行研究，明確熟大黃在治療應(yīng)激性胃潰瘍中的更優(yōu)療效，為進(jìn)一步規(guī)范臨床中大黃使用和加深對(duì)“生熟異用” “生熟有別”理論的認(rèn)識(shí)提供理論數(shù)據(jù).對(duì)于何種化學(xué)成分變化引起生熟大黃在治療急性胃潰瘍的藥效差異，以及大黃臨床治療胃潰瘍的質(zhì)量指標(biāo)還有待研究.